1. ערשט פארשטאנד

אין דעם בינע, מיר דאַרפֿן צו פֿאַרשטיין עטלעכע קאַנסעפּס און טערמינאָלאָגיע, אַזוי צו ויסמיידן מאכן מיסטייקס אין פראָנט פון אונדזער סיניערז, אַזאַ ווי:

ק: וואָס איז די חילוק צווישן RT-PCR, qPCR, פאַקטיש-צייט פּקר און פאַקטיש-צייט RT-PCR?

ענטפער: RT-PCR איז פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּקר(פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּקר, רט-פּקר), וואָס איז אַ וויידלי געניצט וואַריאַנט פון פּאָלימעראַסע קייט רעאַקציע (פּקר).אין RT-PCR, אַ רנאַ שנירל איז פאַרקערט טראַנסקריבעד אין קאַמפּלאַמענטשי דנאַ, וואָס איז דעמאָלט געניצט ווי אַ מוסטער פֿאַר דנאַ אַמפּלאַפאַקיישאַן דורך פּקר.
פאַקטיש-צייט-פּקר און קפּקר(קוואַנטיטאַטיווע רעאַל-לטימע-פּקר) זענען די זעלבע זאַך, ביידע זענען פאַקטיש-צייט קוואַנטיטאַטיווע פּקר, וואָס מיטל אַז יעדער ציקל פון פּקר האט פאַקטיש-צייט דאַטן רעקאָרדס, אַזוי די נומער פון סטאַרטינג טעמפּלאַטעס קענען זיין אַדזשאַסטיד גענוי אַנאַליסיס.

כאָטש ביידע רעאַל-צייט פּקר (פאַקטיש-צייט פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר) און פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּקר (פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּקר) ויסקומען צו זיין אַבריוויייטיד ווי RT-PCR, די אינטערנאַציאָנאַלע קאַנווענשאַן איז: RT-PCR ספּאַסיפיקלי רעפערס צו פאַרקערט טראַנסקריפּציע.PCR, פאַקטיש-צייט פּקר איז בכלל אַבריוויייטיד ווי qPCR (קוואַנטיטאַטיווע פאַקטיש-צייט פּקר).

און פאַקטיש-צייט RT-PCR (RT-qPCR), דאָס איז די פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּקר קאַמביינד מיט די פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע טעכנאָלאָגיע: ערשטער באַקומען cDNA (RT) פֿון רנאַ פאַרקערט טראַנסקריפּציע, און דעמאָלט נוצן פאַקטיש-צייט פּקר פֿאַר קוואַנטיטאַטיווע אַנאַליסיס (qPCR).רובֿ לאַבאָראַטאָריעס טאָן RT-qPCR, דאָס איז, פאָרשונג אויף רנאַ אויסדרוק אַראָפּ-רעגולירן, אַזוי די qPCR וואָס אַלעמען רעדט וועגן אין דער לאַבאָראַטאָריע רעפערס אַקשלי צו RT-qPCR, אָבער טאָן ניט פאַרגעסן אַז עס זענען נאָך פילע דנאַ טעסץ אין קליניש אַפּלאַקיישאַנז.קוואַנטיטאַטיווע אַנאַליסיס, אַזאַ ווי העפּאַטיטיס ב ווירוס הבוו דיטעקשאַן.

פראגע: נאָך לייענען אַ פּלאַץ פון פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר, וואָס זאָל די אַמפּלאַפייד פראַגמענט זיין קאַנטראָולד אין די קייט פון 80-300 בפּ?

ענטפער: די לענג פון יעדער דזשין סיקוואַנס איז אַנדערש, עטלעכע זענען עטלעכע קב, עטלעכע זענען הונדערטער פון בפּ, אָבער מיר נאָר דאַרפֿן צו דאַרפן די פּראָדוקט לענג צו זיין 80-300 בפּ ווען דיזיינינג פּרימערז, צו קורץ אָדער צו לאַנג זענען נישט פּאַסיק פֿאַר פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר דיטעקשאַן.דער פּראָדוקט פראַגמענט איז צו קורץ צו זיין אונטערשיידן פון די אָנפאַנגער-דימער.די לענג פון די אָנפאַנגער-דימער איז וועגן 30-40 בפּ, און עס איז שווער צו ויסטיילן צי עס איז אַ אָנפאַנגער-דימער אָדער אַ פּראָדוקט אויב עס איז ווייניקער ווי 80 בפּ.אויב די פּראָדוקט פראַגמענט איז צו לאַנג, יקסיד 300 בפּ, עס וועט לייכט פירן צו נידעריק אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט און קענען נישט יפעקטיוולי דעטעקט די סומע פון ​​​​די דזשין.

צום ביישפיל, ווען מען ציילט וויפיל מענטשן זענען אין א חדר, דארף מען נאר ציילן וויפיל מויל עס זענען דא.דער זעלביקער איז אמת ווען איר דעטעקט גענעס, איר נאָר דאַרפֿן צו דעטעקט אַ זיכער סיקוואַנס פון אַ דזשין צו פאָרשטעלן די גאנצע סיקוואַנס וועט טאָן.אַז מע װיל צײלן מענטשן, דאַרף מען צײלן סײַ מױל און סײַ נאָז, אויערן און ברילן, און ס'איז גרינג צו מאַכן פֿעלערן.

צו יקספּאַנד, אין בייאַלאַדזשיקאַל פאָרשונג, עס זענען פילע פאָרשונג קאַסעס פון פונט צו געגנט, ווייַל די דזשין סיקוואַנס פון קיין מינים איז זייער לאַנג, עס איז ומנייטיק און אוממעגלעך צו מעסטן אַלע פראַגמאַנץ, אַזאַ ווי באַקטיריאַל 16S סיקוואַנסינג, וואָס איז צו דורכפירן די קאָנסערוואַטיווע סיקוואַנס פון באַקטיריאַ אַסאַסאַז צו אָפּלערנען די נומער פון אַ זיכער באַפעלקערונג פון באַקטיריאַ.

ק: וואָס איז די אָפּטימאַל לענג פֿאַר qPCR אָנפאַנגער פּלאַן?

ענטפער: אין אַלגעמיין, די אָנפאַנגער לענג איז וועגן 20-24 בפּ, וואָס איז בעסער.פון קורס, מיר מוזן באַצאָלן ופמערקזאַמקייט צו די טם ווערט פון די אָנפאַנגער ווען דיזיינינג די אָנפאַנגער, ווייַל דאָס איז שייך צו די אָפּטימאַל אַנילינג טעמפּעראַטור.נאָך אַ פּלאַץ פון יקספּעראַמאַנץ, עס איז פּרוווד אַז 60 ° C איז אַ בעסער טם ווערט.אויב די אַנילינג טעמפּעראַטור איז צו נידעריק, עס וועט לייכט פירן צו ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.אויב די אַנילינג טעמפּעראַטור איז צו הויך, די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט וועט זיין לעפיערעך נידעריק, די שפּיץ פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג וועט אָנהייבן שפּעטער, און די קאָרט ווערט וועט זיין דילייד.

ק: ווי איז די פאַרב אופֿן אַנדערש פון די זאָנד אופֿן?

ענטפער: דיע אופֿןעטלעכע פלורעסאַנט דיעס, אַזאַ ווי SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, אאז"ו ו, טאָן ניט אַרויסלאָזן ליכט אַליין, אָבער וועט אַרויסלאָזן פלורעסאַנס נאָך ביינדינג צו די מינערווערטיק נאָרע פון ​​טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ.דעריבער, אין די אָנהייב פון די פּקר אָפּרוף, די מאַשין קענען נישט דעטעקט די פלורעסאַנט סיגנאַל.ווען דער אָפּרוף ריטשאַז די אַנילינג-פאַרלענגערונג בינע, די טאָפּל שנירל איז געעפנט, און אַ נייַ שנירל איז סינטאַסייזד אונטער דער קאַמף פון דנאַ פּאָלימעראַסע, און די פלורעסאַנט מאַלאַקיול ביינדז צו די דסדנאַ מינערווערטיק נאָרע.ווי די נומער פון פּקר סייקאַלז ינקריסיז, מער און מער דייז זענען קאַמביינד מיט טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ, און די פלורעסאַנט סיגנאַל איז אויך קאַנטיניואַסלי ימפּרוווד.דער פאַרב אופֿן איז דער הויפּט געניצט אין וויסנשאפטלעכע פאָרשונג.
פּס: זיין אָפּגעהיט ווען איר טאָן דעם עקספּערימענט, די פאַרב מוזן זיין קאַמביינד מיט מענטש דנאַ, זיין אָפּגעהיט צו מאַכן עס אַ פלורעסאַנט מענטש.

פאַרב אופֿן (לינקס) פּראָבע אופֿן (רעכט)
פּס: זיין אָפּגעהיט ווען איר טאָן דעם עקספּערימענט, די פאַרב מוזן זיין קאַמביינד מיט מענטש דנאַ, זיין אָפּגעהיט צו מאַכן עס אַ פלורעסאַנט מענטש.

SYBR גרין Ⅰ ביינדז צו די מינערווערטיק נאָרע פון ​​דנאַ

פּראָבע אופֿןטאַקמאַן זאָנד איז די מערסט קאַמאַנלי געניצט כיידראַלאַסאַס זאָנד.עס איז אַ פלורעסאַנט גרופּע אין די 5′ סוף פון די זאָנד, יוזשאַוואַלי FAM, און די זאָנד זיך איז אַ סיקוואַנס קאַמפּלאַמענטשי צו די ציל דזשין.עס איז אַ פלורעסאַנט קווענטשינג גרופּע אין די 3′ סוף.לויט דעם פּרינציפּ פון פלורעסאַנס אפקלאנג ענערגיע אַריבערפירן (Förster אפקלאנג ענערגיע אַריבערפירן, FRET), ווען די רעפּאָרטער פלורעסאַנט גרופּע (מענאַדעוו פלורעסאַנט מאַלאַקיול) און די קווענטשינג פלורעסאַנט גרופּע (אַקסעפּטאָר פלורעסאַנט מאַלאַקיול) זענען יקסייטאַד ווען די ספּעקטראַ אָוווערלאַפּ און די דיסטאַנסע איז זייער נאָענט (7-10 סענטימעטער פון די פלואָראַנס פון די יקסייטמאַנט פון די פלואָרעס). די אַקסעפּטאָר מאַלאַקיול, בשעת די אַוטאָפלאָרעססענסע איז וויקאַנד.דעריבער, אין די אָנהייב פון די פּקר אָפּרוף, ווען די זאָנד איז פריי און בעשאָלעם אין די סיסטעם, די רעפּאָרטער פלורעסאַנט גרופּע וועט נישט אַרויסלאָזן פלורעסאַנס.ווען אַנילינג, די אָנפאַנגער און זאָנד בינדן צו די מוסטער.בעשאַס די פאַרלענגערונג בינע, די פּאָלימעראַסע קאַנטיניואַסלי סינטאַסייזיז נייַע קייטן.דנאַ פּאָלימעראַסע האט 5′-3′ עקסאָנוקלעאַסע טעטיקייט.ווען ריטשינג די זאָנד, די דנאַ פּאָלימעראַסע וועט כיידראַליזירן די זאָנד פון די מוסטער, באַזונדער די רעפּאָרטער פלורעסאַנט גרופּע פון ​​די קווענטשער פלורעסאַנט גרופּע און מעלדונג די פלורעסאַנט סיגנאַל.זינט עס איז אַ איין-צו-איינער שייכות צווישן די זאָנד און די מוסטער, די זאָנד אופֿן איז העכער ווי די פאַרב אופֿן אין טערמינען פון די אַקיעראַסי און סענסיטיוויטי פון די פּראָבע.דער זאָנד אופֿן איז דער הויפּט געניצט אין דיאַגנאָסיס.

ק: וואָס איז אַבסאָלוט קוואַנטיפיקאַטיאָן?וואָס איז קאָרעוו קוואַנטיפיקאַטיאָן?

ענטפער: אַבסאָלוט קוואַנטיפיקאַטיאָן רעפערס צו די כעזשבן פון די ערשט קאָפּיע נומער פון די מוסטער צו זיין טעסטעד דורך qPCR, אַזאַ ווי ווי פילע HBV ווירוסעס זענען אין 1 מל פון בלוט.דער רעזולטאַט באקומען דורך קאָרעוו קוואַנטאַפאַקיישאַן איז די ענדערונג אין די סומע פון ​​​​די ציל דזשין אין אַ ספּעציפיש מוסטער קאָרעוו צו אן אנדער רעפֿערענץ מוסטער, און די דזשין אויסדרוק איז אַרויף-רעגיאַלייטאַד אָדער אַראָפּ-רעגיאַלייטאַד.

ק: וועט די סומע פון ​​רנאַ יקסטראַקשאַן, פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט און אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט ווירקן די יקספּערמענאַל רעזולטאַטן?
ק: וועט מוסטער סטאָרידזש, יקסטראַקשאַן רייידזשאַנץ, פאַרקערט טראַנסקריפּציע רייידזשאַנץ און ליכט-טראַנסמיטינג קאָנסומאַבלעס ווירקן די יקספּערמענאַל רעזולטאַטן?
ק: וואָס אופֿן קענען ריכטיק די יקספּערמענאַל דאַטן?

וועגן די ישוז, מיר וועלן באַשרייַבן זיי אין דעטאַל אין די אַוואַנסירטע און אַוואַנסירטע סעקשאַנז אונטן.
2. אַוואַנסירטע וויסן

מיט אַכטונג צו פאַקטיש-צייט פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר, מיר מוזן דערקענען די פאַקט אַז טויזנטער פון וויסנשאפטלעכע פאָרשונג צייטונגען זענען ארויס יעדער יאָר, צווישן וואָס די פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר טעכנאָלאָגיע איז נישט אַ קליין נומער.

אויב עס איז קיין פּראָסט נאָרמאַל צו מעסטן די פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר עקספּערימענט, די רעזולטאַטן קען זיין וויידלי בייַטן.פֿאַר די זעלבע דזשין פון די זעלבע מינים, מיט דער זעלביקער פּראַסעסינג אופֿן, די דיטעקשאַן רעזולטאַטן וועלן אויך בייַטן וויידלי, און עס וועט זיין שווער פֿאַר לייטקאַמערז צו איבערחזרן די זעלבע רעזולטאַטן.איר קיין איינער ווייסט וואָס איז רעכט און וואָס איז פאַלש.

טוט דאָס מיינען אַז פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר איז אַ אָפּנאַרן טעכנאָלאָגיע אָדער אַ אַנרילייאַבאַל טעכנאָלאָגיע?ניין, דאָס איז ווייַל פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר איז מער שפּירעוודיק און מער פּינטלעך, און אַ ביסל פאַלש אָפּעראַציע וועט פּראָדוצירן גאָר פאַרקערט רעזולטאַטן.א קליין אָנווער איז אַ טויזנט מייל אַוועק.דער מחבר פון דעם אַרטיקל קען זיין ריפּיטידלי טאָרטשערד דורך די ריוויוערז.אין דער זעלביקער צייַט, די ריוויוערז פון דעם זשורנאַל זענען אויך שווער צו קלייַבן פון פאַרשידענע יקספּערמענאַל רעזולטאַטן.

אַלע אין אַלע, פּוינטינג צו אַ פעלן פון קאָנסענסוס אין פאַקטיש-צייט פּקר יקספּעראַמאַנץ.צו דעם סוף, עלטער סייאַנטיס אין די אינדוסטריע אנגעהויבן צו פאָרמולירן סטאַנדאַרדס,ריקוויירינג מיטארבעטערס צו צושטעלן עטלעכע נויטיק יקספּערמענאַל און דאַטן פּראַסעסינג דעטאַילס (אַרייַנגערעכנט נייטיק דאַטן) אין דעם אַרטיקל צו טרעפן די סטאַנדאַרדס.

ריוויוערז קענען ריכטער די קוואַליטעט פון דער עקספּערימענט דורך לייענען די דעטאַילס;צוקונפֿט לייענער קענען אויך נוצן דעם צו איבערחזרן דעם עקספּערימענט אָדער פֿאַרבעסערן דעם עקספּערימענט.דערנאָך די יקספּערמענאַל רעזולטאַטן באקומען אין דעם וועג זענען פול פון אינפֿאָרמאַציע, הויך קוואַליטעט און ניצלעך.

MIBBI (מינימום אינפֿאָרמאַציע פֿאַר בייאַלאַדזשיקאַל און ביאָמעדיקאַל ינוועסטאַגיישאַנז -http://www.mibbi.org) געקומען אין זיך.MIBBI איז אַ פּרויעקט וואָס גיט סטאַנדאַרדס פֿאַר יקספּעראַמאַנץ.עס איז ארויס אין נאַטור.דער פּרויעקט איז אַימעד בייַ פאַרשידן בייאַלאַדזשיקאַל יקספּעראַמאַנץ, אַרייַנגערעכנט צעל ביאָלאָגי, מיקראָאַררייַ, qPCR מיר וועלן דיסקוטירן איצט, אאז"ו ו, און גיט פֿאַר יעדער טיפּ פון עקספּערימענט ווען פאָרלייגן מאַנוסקריפּץ.די אינפֿאָרמאַציע זאָל זיין צוגעשטעלט אין אַלע צייט.

אין די MIBBI פּרויעקט, עס זענען צוויי אַרטיקלען שייך צו פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר, ניימלי.:
· RDML (רעאַל-צייט פּקר דאַטאַ מאַרקאַפּ שפּראַך) - אַ סטראַקטשערד שפּראַך און ריפּאָרטינג פירער פֿאַר פאַקטיש-צייט קוואַנטיטאַטיווע פּקר דאַטן;
· MIQE (מינימום אינפֿאָרמאַציע פֿאַר ארויסגעבן פון קוואַנטיטאַטיווע פאַקטיש-צייט פּקר יקספּעראַמאַנץ) - מינימום אינפֿאָרמאַציע פֿאַר ארויסגעבן אַרטיקלען וועגן פאַקטיש-צייט קוואַנטיטאַטיווע פּקר יקספּעראַמאַנץ.
ערשטער, לאָמיר רעדן וועגן RDML, די טערמינאָלאָגיע באַשרייַבונג.

אויב עס איז קיין נאָרמאַל דעפֿיניציע פֿאַר אַלץ, עס איז אוממעגלעך צו פאָרזעצן די דיסקוסיע, וואָס איז וואָס די דערקלערונג פון טערמינען איז אַזוי וויכטיק אין די יגזאַם.
די טערמינאָלאָגיע געניצט אין די פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר עקספּערימענט כולל די פאלגענדע אינהאַלט.QIAGEN האט געמאכט די בעסטער קיצער פֿאַר אונדז.די פאלגענדע זענען אַלע טרוקןסכוירע .

אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג
די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג רעפערס צו די ויסבייג געמאכט בעשאַס די פּקר פּראָצעס, מיט די ציקל נומער ווי די אַבססיס און די פאַקטיש-צייט פלואָרעססענסע ינטענסיטי בעשאַס דער אָפּרוף ווי די אָרדאַנאַט.

אַ ויסגעצייכנט אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג זאָל האָבן די פאלגענדע קעראַקטעריסטיקס: די באַסעלינע איז פלאַך אָדער אַ ביסל דיקריסט, און עס איז קיין קלאָר ווי דער טאָג אַרוף גאַנג;די ינפלעקשאַן פונט פון די ויסבייג איז קלאָר, און די שיפּוע פון ​​די עקספּאָונענשאַל פאַסע איז פּראַפּאָרשאַנאַל צו די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט.די גרעסער די שיפּוע, די העכער די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט;די קוילעלדיק אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג די פּאַראַלעליסם איז גוט, וואָס ינדיקייץ אַז די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט פון יעדער רער איז ענלעך;די עקספּאָונענשאַל פאַסע פון ​​די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג פון נידעריק-קאַנסאַנטריישאַן סאַמפּאַלז איז קלאָר ווי דער טאָג.

באַסעלינע (באַסעלינע)
די באַסעלינע איז די ראַש מדרגה פון דער פרי ציקל, יוזשאַוואַלי געמאסטן צווישן די 3 און 15 ציקל, ווייַל די פלואָרעססענסע ווערט פאַרגרעסערן געפֿירט דורך די אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט קענען ניט זיין דיטעקטאַד בעשאַס דעם פּעריאָד.די נומער פון סייקאַלז געניצט צו רעכענען די באַסעלינע קענען זיין וועריד און קען זיין רידוסט אויב הויך מוסטער אַמאַונץ זענען געניצט אָדער אויב די אויסדרוק מדרגה פון די ציל דזשין איז הויך.

באַשטעטיקן די באַסעלינע ריקווייערז וויוינג פלואָרעססענסע דאַטן פֿון די לינעאַריטי אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג.די באַסעלינע איז באַשטימט אַזוי אַז דער וווּקס פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג הייבט מיט אַ ציקל נומער גרעסער ווי די באַסעלינע ציקל שפּיץ נומער.באַסעלינעס דאַרפֿן צו זיין באַשטימט ינדיווידזשואַלי פֿאַר יעדער ציל סיקוואַנס.די דורכשניטלעך פלורעסאַנס וואַלועס דיטעקטאַד אין די פרי סייקאַלז דאַרפֿן צו זיין סאַבטראַקטיד פון די פלואָרעססענסע וואַלועס באקומען אין די אַמפּלאַפייד פּראָדוקטן.די לעצטע ווערסיעס פון פאַרשידן פאַקטיש-צייט פּקר ווייכווארג לאָזן אָטאַמאַטיק אַפּטאַמאַזיישאַן פון באַסעלינע סעטטינגס פֿאַר יחיד סאַמפּאַלז.

בעשאַס דער ערשטער ביסל סייקאַלז פון די פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן אָפּרוף, די פלואָרעססענסע סיגנאַל טוט נישט טוישן פיל.צוגאַנג צו אַ גלייַך שורה איז גערופן די באַסעלינע, אָבער אויב מיר קוקן ענג אין די ערשטער ביסל סייקאַלז, מיר זען אַז אין די באַסעלינע איז וואָס איז געשעעניש אין די בילד אונטן.

הינטערגרונט הינטערגרונט רעפערס צו
די ניט-ספּעציפיש פלואָרעססענסע ווערט אין דער אָפּרוף.פֿאַר בייַשפּיל: באַטלאָניש פלואָרעססענסע קווענטשינג;אָדער אַ גרויס נומער פון טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ טעמפּלאַטעס רעכט צו דער נוצן פון SYBR גרין.די הינטערגרונט קאַמפּאָונאַנץ פון די סיגנאַל זענען מאַטאַמאַטיקאַללי אַוועקגענומען דורך די פאַקטיש-צייט פּקר ווייכווארג אַלגערידאַם.

רעפּאָרטער סיגנאַל
רעפּאָרטער סיגנאַל רעפערס צו די פלורעסאַנט סיגנאַל דזשענערייטאַד דורך SYBR גרין אָדער פלורעסאַנטלי מיטן נאָמען סיקוואַנס-ספּעציפיש פּראָבעס בעשאַס פאַקטיש-צייט פּקר.

נאָרמאַליזעד רעפּאָרטער סיגנאַל (רן)
RN רעפערס צו די פלואָרעססענסע ינטענסיטי פון די רעפּאָרטער פאַרב צעטיילט דורך די פלואָרעססענסע ינטענסיטי פון די פּאַסיוו רעפֿערענץ פאַרב געמאסטן אין יעדער ציקל.

פּאַסיוו רעפערענץ פאַרב
אין עטלעכע פאַקטיש-צייט פּקר,די פלורעסאַנט פאַרב ROX איז געניצט ווי אַ ינערלעך רעפֿערענץ צו נאָרמאַלייז די פלורעסאַנט סיגנאַל.עס קערעקץ פֿאַר ווערייישאַנז רעכט צו ומפּינקטלעך פּייטטינג, געזונט שטעלע און פלואָרעססענסע פלאַקטשויישאַנז אויף אַ געזונט-ביי-געזונט יקער.

די פלורעסאַנס שוועל (שוועל)
איז אַדזשאַסטיד אויבן די הינטערגרונט ווערט און באטייטיק אונטער די פּלאַטאָ ווערט פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג.עס מוזן ליגן אין די לינעאַר געגנט פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג, רעפּריזענטינג די קלאָץ-לינעאַר קייט פון פּקר דיטעקשאַן.טהרעשאָלדס זאָל זיין שטעלן אין די לאָג-אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג מיינונג אַזוי אַז די קלאָץ-לינעאַר פאַסע פון ​​פּקר איז לייכט ידענטיפיאַבלע.אויב עס זענען קייפל ציל גענעס אין פאַקטיש-צייט פּקר, די שוועל מוזן זיין באַשטימט פֿאַר יעדער ציל.אין אַלגעמיין, די פלורעסאַנס סיגנאַל פון דער ערשטער 15 סייקאַלז פון פּקר אָפּרוף איז געניצט ווי די פלורעסאַנס הינטערגרונט סיגנאַל, און די פלורעסאַנס שוועל איז 10 מאל די נאָרמאַל דיווייישאַן פון די פלורעסאַנס סיגנאַל פון דער ערשטער 3-15 סייקאַלז פון פּקר, און די פלואָרעססענסע שוועל איז באַשטימט אין די עקספּאָונענשאַל פאַסע פון ​​​​פּקר.אין אַלגעמיין, יעדער קיילע האט זייַן פלורעסאַנס שוועל שטעלן פֿאַר נוצן.

ציקל שוועל (CT) אָדער אַריבער פונט (CP)
דער ציקל אין וואָס די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג קראָסיז די שוועל (ד"ה די פונט אין וואָס פלורעסאַנס דיטעקשאַן ינקריסיז באטייטיק).CT קענען זיין אַ בראָכצאָל און די סומע פון ​​סטאַרטינג מוסטער קענען זיין קאַלקיאַלייטיד.די קאָרט ווערט רעפּראַזענץ די נומער פון סייקאַלז יקספּיריאַנסט ווען די פלורעסאַנט סיגנאַל אין יעדער פּקר אָפּרוף רער ריטשאַז די באַשטימט שוועל.עס איז אַ לינעאַר באַציונג צווישן די CT ווערט פון יעדער טעמפּלאַטע און די לאָגאַריטהם פון די ערשט קאָפּיע נומער פון די מוסטער.העכער די ערשט קאָפּיע נומער, די קלענערער די CT ווערט, און וויצע ווערסאַ.א נאָרמאַל ויסבייג קענען זיין געמאכט דורך ניצן אַ נאָרמאַל מיט באַוווסט ערשט קאָפּיע נומער, אין וואָס די אַבססיס רעפּראַזענץ די קאָרט ווערט, און די אָרדינאַטע רעפּראַזענץ די לאָגאַריטהם פון די ערשט קאָפּיע נומער.דעריבער, ווי לאַנג ווי די CT ווערט פון די אומבאַקאַנט מוסטער איז באקומען, די ערשט קאָפּיע נומער פון די מוסטער קענען זיין קאַלקיאַלייטיד פון די נאָרמאַל ויסבייג.

ΔCT ווערט
ΔCT ווערט באשרייבטדי חילוק צווישן די ציל דזשין און די קאָראַספּאַנדינג ענדאָגענאָוס רעפֿערענץ דזשין קאָרט ווערט, אַזאַ ווי אַ כאַוסקיפּינג דזשין, און איז געניצט צו נאָרמאַלייז די סומע פון ​​​​טעמפּלאַטע געניצט:
⇒ΔCT = CT (ציל דזשין) - CT (ענדאָגענאָוס רעפֿערענץ דזשין)

ΔΔCT ווערט
די ΔΔCT ווערט באשרייבט די חילוק צווישן די דורכשניטלעך ΔΔCT ווערט פון אַ מוסטער פון אינטערעס (למשל, סטימיאַלייטאַד סעלז) און די דורכשניטלעך ΔΔCT ווערט פון אַ רעפֿערענץ מוסטער (למשל, אַנסטימיאַלייטיד סעלז).דער רעפֿערענץ מוסטער איז אויך גערופן די קאַלאַבריישאַן מוסטער און אַלע אנדערע סאַמפּאַלז זענען נאָרמאַלייזד צו דעם פֿאַר קאָרעוו קוואַנטאַפאַקיישאַן:
⇒ΔΔCT = דורכשניטלעך ΔCT (מוסטער פון אינטערעס) - דורכשניטלעך ΔCT (רעפֿערענץ מוסטער)

ענדאָגענאָוס רעפֿערענץ גענעס (ענדאָגענאָוס רעפֿערענץ גענעס)
די אויסדרוק לעוועלס פון ענדאָגענאָוס רעפֿערענץ גענעס, אַזאַ ווי כאַוסקיפּינג גענעס (הויזקיפּינג גענעס), זענען נישט אַנדערש צווישן סאַמפּאַלז.קאַמפּערינג די CT וואַלועס פון די רעפֿערענץ דזשין צו די ציל דזשין אַלאַוז די אויסדרוק מדרגה פון די ציל דזשין צו נאָרמאַלייזד צו די סומע פון ​​אַרייַנשרייַב רנאַ אָדער cDNA (זען די אָפּטיילונג אויף ΔCT וואַלועס אויבן).

ינערלעך דערמאָנען גענעס ריכטיק פֿאַרמעגלעך רנאַ דערנידעריקונג אָדער די בייַזייַן פון ענזיים ינכיבאַטערז אין רנאַ סאַמפּאַלז, ווי ווויל ווי ווערייישאַנז אין רנאַ אינהאַלט, פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט, נוקלעיק זויער אָפּזוך און מוסטער האַנדלינג.צו אויסקלייַבן די אָפּטימאַל רעפֿערענץ דזשין (s), מיר מאַדאַפייד די אַלגערידאַם צו לאָזן זיין סעלעקציע פון ​​די אָפּטימאַל רעפֿערענץ אָפענגיק אויף די יקספּערמענאַל באַשטעטיקן.

אינערלעכער קאָנטראָל
א קאָנטראָל סיקוואַנס וואָס איז אַמפּלאַפייד אין דער זעלביקער אָפּרוף ווי די ציל סיקוואַנס און פּראָוד מיט אַ אַנדערש זאָנד (ד"ה פּערפאָרמינג דופּלעקס פּקר).ינערלעך קאָנטראָלס זענען אָפט געניצט צו ויסשליסן דורכפאַל אַמפּלאַפאַקיישאַנז, אַזאַ ווי ווען די ציל סיקוואַנס איז נישט דיטעקטאַד.
קאַלאַבריישאַן מוסטער
א רעפֿערענץ מוסטער (פֿאַר בייַשפּיל, פּיוראַפייד רנאַ פון אַ צעל ליניע אָדער געוועב) געניצט אין קאָרעוו קוואַנטאַפאַקיישאַן צו פאַרגלייַכן אַלע אנדערע סאַמפּאַלז צו באַשטימען די קאָרעוו אויסדרוק מדרגה פון אַ דזשין.די קאַלאַבריישאַן מוסטער קענען זיין קיין מוסטער, אָבער איז יוזשאַוואַלי אַ קאָנטראָל (למשל, אַ אַנטריטיד מוסטער אָדער אַ מוסטער פֿון צייט נול פון דער עקספּערימענט).

positive קאָנטראָלס
נוצן קאָנטראָל ריאַקשאַנז מיטבאקאנט אַמאַונץ פון מוסטער.Positive קאָנטראָלס זענען אָפט געניצט צו קאָנטראָלירן אַז אַ אָנפאַנגער שטעלן אָדער אָנפאַנגער-זאָנד שטעלן איז ארבעטן רעכט און אַז דער אָפּרוף איז ריכטיק.

קיין מוסטער קאָנטראָל (NTC)
א קאָנטראָל אָפּרוף וואָס כּולל אַלע די נייטיק קאַמפּאָונאַנץ פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן אָפּרוף אַחוץ די מוסטער, וואָס איז יוזשאַוואַלי ריפּלייסט מיט וואַסער.די נוצן פון NTC קענען געפֿינען קאַנטאַמאַניישאַן געפֿירט דורך רייידזשאַנט קאַנטאַמאַניישאַן אָדער פרעמד דנאַ, אַזוי ינשורינג די אָטאַנטיסיטי און רילייאַבילאַטי פון די דיטעקשאַן דאַטן.אַמפּלאַפאַקיישאַן פון די NTC קאָנטראָל ינדיקייץ קאַנטאַמאַניישאַן.

קיין RT קאָנטראָל (NRT)
רנאַ יקסטראַקשאַן פּראָצעס קען אַנטהאַלטן ריזידזשואַל גענאָמיק דנאַ, וואָס איז גאָר שעדלעך און איז די קולפּריט וואָס אַפעקץ דאַטן קוואַליטעט און די נאַטירלעך פייַנט פון qPCR, אַזוי ווען דיזיינינג יקספּעראַמאַנץ, עס מוזן זיין דיזיינד בלויז צו פאַרגרעסערן רנאַ דיטעקשאַן.עס זענען צוויי וועגן, איינער איז צו פּלאַן פּרימערז אַריבער ינטראָנס, די אנדערע איז צו גאָר באַזייַטיקן DNA, וואָס איינער איז בעסער, וואָס וועט זיין דיסקאַסט שפּעטער.די NTR קאָנטראָל איז אַ מאַגיש שפּיגל צו דעטעקט דנאַ פאַרפּעסטיקונג.אויב עס איז אַמפּלאַפאַקיישאַן, עס מיטל אַז עס איז פאַרפּעסטיקונג.

סטאַנדאַרדס
סטאַנדאַרדס זענען סאַמפּאַלז פון באקאנט קאַנסאַנטריישאַן אָדער קאָפּיע נומער וואָס זענען געניצט צו בויען אַ נאָרמאַל ויסבייג.אין סדר צו ענשור די פעסטקייַט פון די סטאַנדאַרט, די דזשין פראַגמענט איז יוזשאַוואַלי קלאָונד אין די פּלאַזמיד און געוויינט ווי דער נאָרמאַל.

דער נאָרמאַל ויסבייג
איז יוזשאַוואַלי דיילוטאַד אין בייַ מינדסטער 5 קאַנסאַנטריישאַן גראַדיענץ מיט די נאָרמאַל פּראָדוקט לויט די דאַבלינג פאַרהעלטעניש, און 5 פונקטן זענען ציען אין די קאָואָרדאַנאַץ פון קאָרט ווערט און קאָפּיע נומער, און די פונקטן זענען פארבונדן צו פאָרעם אַ שורה צו דזשענערייט אַ נאָרמאַל ויסבייג.פֿאַר יעדער נאָרמאַל ויסבייג, זייַן גילטיקייַט דאַרף זיין אָפּגעשטעלט.די שיפּוע ווערט פאלן צווישן -3.3 און -3.8, און יעדער קאַנסאַנטריישאַן איז דורכגעקאָכט אין טריפּליקאַט.נקודות וואָס זענען באטייטיק אַנדערש פון אנדערע פונקטן זאָל זיין אַוועקגענומען.די CT ווערט פון די מוסטער צו זיין טעסטעד איז געבראכט אין די נאָרמאַל ויסבייג, און די אויסדרוק מדרגה פון די מוסטער צו זיין טעסטעד קענען זיין קאַלקיאַלייטיד.

די CT ווערט פון די מוסטער צו זיין טעסטעד איז געבראכט אין די נאָרמאַל ויסבייג, און די ערשט קאָפּיע נומער פון די מוסטער צו זיין טעסטעד קענען זיין קאַלקיאַלייטיד.

עפעקטיווקייַט און סלאָופּ
די שיפּוע פון ​​די נאָרמאַל ויסבייג רעפּראַזענץ די עפעקטיווקייַט פון פאַקטיש-צייט פּקר.
· א שיפּוע פון ​​-3.322 ינדיקייץ אַז די פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט איז 1, אָדער 100% עפעקטיוו, און די סומע פון ​​​​פּקר פּראָדוקט דאַבאַלז אין יעדער ציקל.
· א שיפּוע ווייניקער ווי -3.322 (למשל, -3.8) ינדיקייץ אַ פּקר עפעקטיווקייַט
· א שיפּוע גרעסער ווי -3.322 (למשל -3.0) ינדיקייץ אַז די פּקר עפעקטיווקייַט איז מער ווי 100%, וואָס איז טשיקאַווע, ווי קען איין ציקל פון פּקר דזשענערייט מער ווי טאָפּל די אַמפּלאַפייד פּראָדוקט?דעם סיטואַציע אַקערז אין די ניט-לינעאַר פאַסע פון ​​די פּקר אָפּרוף, דאָס איז, עס איז אַ גרויס סומע פון ​​ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.

מעלטינג ויסבייג
נאָך די qPCR אַמפּלאַפאַקיישאַן איז געענדיקט, די פּקר פּראָדוקט איז העאַטעד.ווען די טעמפּעראַטור ריסעס, די טאָפּל-סטראַנדיד אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט ביסלעכווייַז מעלץ, ריזאַלטינג אין אַ פאַרקלענערן אין פלואָרעססענסע ינטענסיטי.ווען אַ זיכער טעמפּעראַטור (טם) איז ריטשט, אַ גרויס נומער פון פּראָדוקטן וועט צעלאָזן.פלואָרעססענסע טראפנס שארף.פאַרשידענע פּקר פּראָדוקטן האָבן פאַרשידענע טם וואַלועס און פאַרשידענע מעלטינג טעמפּעראַטורעס, אַזוי אַז די ספּעסיפיקאַטי פון פּקר קענען זיין יידענאַפייד.

מעלטינג ויסבייג (דעריוואַטיוו ויסבייג)
די מעלטינג ויסבייג איז דערייווד צו פאָרעם אַ שפּיץ מאַפּע, וואָס קענען מער ינטואַטיוו אַרויסווייַזן די סיטואַציע פון ​​PCR פּראָדוקט פראַגמאַנץ.זינט די מעלטינג טעמפּעראַטור איז די טם ווערט פון די דנאַ פראַגמענט, עטלעכע פּאַראַמעטערס וואָס ווירקן די טם ווערט פון די דנאַ פראַגמענט קענען זיין געמשפט, אַזאַ ווי פראַגמענט גרייס, גק אינהאַלט, אאז"ו ו. בכלל גערעדט, לויט אונדזער אָנפאַנגער פּלאַן פּרינסאַפּאַלז,די לענג פון די אַמפּלאַפייד פּראָדוקט איז אין די קייט פון 80-300 בפּ, אַזוי די מעלטינג טעמפּעראַטור זאָל זיין צווישן 80 °C און 90 °C.

ינטערפּריטיישאַן פון די מעלטינג ויסבייג: אויב דער בלויז הויפּט שפּיץ איז צווישן 80 ° C-90 ° C, עס מיטל אַז די פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר איז גאנץ;אויב דער הויפּט שפּיץ איז צווישן 80 ° C-90 ° C און פאַרשידן פּיקס דערשייַנען אונטער 80 ° C, די אָנפאַנגער דימער איז בייסיקלי קאַנסידערד.איר קענען פּרובירן צו פאַרגרעסערן די אַנילינג טעמפּעראַטור צו סאָלווע עס;אויב דער הויפּט שפּיץ איז צווישן 80 ° C-90 ° C, און די פאַרשידן שפּיץ איז ווידער ווען די טעמפּעראַטור ריסעס, עס איז בייסיקלי באַטראַכט אַז עס איז דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן, און דנאַ דאַרף זיין אַוועקגענומען אין דער ערשט בינע פון ​​​​דער עקספּערימענט.

פון קורס, עס זענען נאָך עטלעכע אַבנאָרמאַל סיטואַטיאָנס, וואָס וועט זיין צעבראכן אַראָפּ איינער דורך איינער אונטן.
3. אַוואַנסירטע וויסן

צו טאָן qPCR, איך האָבן צו זאָגן MIQE,מינימום אינפֿאָרמאַציעפֿאַר ארויסגעבן פוןקוואַנטיטאַטיוועפאַקטיש-צייט פּקריקספּעראַמאַנץ - די מינימום אינפֿאָרמאַציע פֿאַר ארויסגעבן אַרטיקלען וועגן פאַקטיש-צייט קוואַנטיטאַטיווע פּקריקספּעראַמאַנץ .כּדי צו פאַרפּאָשעטערן דעם שכל פון יעדן, וועלן מיר פאַרפּאָשעטערן דעם שליסל אינהאַלט.

איר קענט זוכן דעם אָריגינעל טעקסט פון MIQE אויף דער אינטערנעץ, און די מערסט וויכטיק זאַך איז אַז עס סטיפּיאַלייץ דידאַטן טשעקליסט וואָס דאַרף זיין צוגעשטעלט ווען ארויסגעבן אַן אַרטיקל .

ריוויוערז קענען ריכטער די קוואַליטעט פון דער עקספּערימענט דורך לייענען די דעטאַילס;צוקונפֿט לייענער קענען אויך נוצן דעם צו איבערחזרן אָדער פֿאַרבעסערן דעם עקספּערימענט.
עס איז כדאי צו באמערקן אַז אין דעם רשימה, די וויכטיקייט פון יעדער רשימה איז אנגעצייכנט מיט E אָדער D ריספּעקטיוולי.וואס מיינט עס?E: יקערדיק אינפֿאָרמאַציע (מוזן זיין דערלאנגט);ד: דיזייעראַבאַל אינפֿאָרמאַציע (צושטעלן ווי פיל ווי מעגלעך).

MIQE (1) - עקספּערימענטאַל פּלאַן
פילע סקומבאַגס וואָס האָבן געענדיקט זייער פאַרטיידיקונג נאָך ענדיקן זייער גראַדזשאַוואַט שטודיום, וועלן נישט וויסן ווי צו פּלאַן אַן עקספּערימענט ינדיפּענדאַנטלי, עפענען זייער נאָוטבוקס און טאָן וואָס דער לערער דערציילט זיי צו טאָן.ווי אַ רעזולטאַט, די יקספּערמענאַל פּלאַן איז נישט שטרענג, און די רעדאקציע אָפּטיילונג פון דעם זשורנאַל האט געזאגט אַז זיי ווילן צו מאַכן דעם בילד און דאָס בילד, אַזוי זיי האבן עס אין אַ פאַרטשעפּען.אט אזוי מאכט מען די שוטים!

נעענטער צו שטוב, דער ערשטער פּרינציפּ פון דער עקספּערימענט איז צו באַשליסןדי שטרענגקייַט פון די יקספּערמענאַל לאָגיק.די מערסט פונדאַמענטאַל זאַך איז די יקספּערמענאַל פּלאַן, און די מערסט וויכטיק זאַך וועגן די יקספּערמענאַל פּלאַן איז ווי צו שטעלן די ציל מוסטער, רעפֿערענץ מוסטער (קאָנטראָל) און די נומער פון רעפּאַטישאַנז, אַזוי אַז די יקספּערמענאַל דאַטן קענען זיין רעפעראַנסט, פאַרגלייַכלעך און קאַנווינסינג.

דער ציל מוסטעררעפערס צו דער מוסטער וואָס ריקווייערז אונדז צו דעטעקט די ציל דזשין נאָך אַ זיכער באַהאַנדלונג.דער רעפֿערענץ מוסטעראיז דער מוסטער אָן קיין באַהאַנדלונג, וואָס איז אָפט ריפערד צו ווי ווילד טיפּ אין ביאָלאָגי.

עקספּערימענטאַל רעפּלאַקייטןזענען זייער וויכטיק.אין אַלגעמיין, די נומער פון פּערסווייסיוו רעפּלאַקאַז מוזן זיין מער ווי דרייַ.עס איז נייטיק צו ויסטיילן וואָס איז בייאַלאַדזשיקאַל רעפּלאַקיישאַן און וואָס איז טעכניש רעפּלאַקיישאַן.

בייאַלאַדזשיקאַל רעפּלאַקייטן: דער זעלביקער וועראַפאַקיישאַן עקספּערימענט געטאן מיט פאַרשידענע מאַטעריאַלס (צייט, געוויקסן, באַטשאַז, אָפּרוף פּלאַטעס).

בייאַלאַדזשיקאַל דופּליקאַטיאָן
זאל ס נעמען די פּעסטאַסייד באַהאַנדלונג פון פעפער ווי אַ בייַשפּיל.מיר ווילן צו שפּריצן פּעסטאַסיידז אויף די דריי אַבק געוויקסן, און די דריי אַבק געוויקסן זענען דריי בייאַלאַדזשיקאַל רעפּלאַקייטן, און זיי זענען די זעלבע וועראַפאַקיישאַן עקספּערימענט מיט פאַרשידענע מאַטעריאַלס.אבער ווי אַן עקספּערימענט, אַ קאָנטראָל איז באשטימט דארף, אַזוי מיר קענען שפּריץ איינער פון די צווייגן פון פאַבריק א צו פאָרעם אַן יקספּערמענאַל גרופּע פון ​​​​פּלאַנץ א, און נישט שפּריץ די אנדערע צווייגן פון פאַבריק א צו פאָרעם אַ קאָנטראָל גרופּע.טאָן די זעלבע פֿאַר B און C.

טעכניש רעפּלאַקייטן (טעכניש רעפּלאַקייטן): עס איז אַ ריפּיטיד עקספּערימענט דיזיינד צו ויסמיידן ערראָרס געפֿירט דורך אָפּעראַציע, וואָס איז פאקטיש אַ דופּליקאַט לאָך אַרייַנגערעכנט אין דער זעלביקער מאַטעריאַל.ביידע טריטמאַנץ און קאָנטראָלס מוזן האָבן רעפּלאַקייט סעטטינגס (מינימום דריי) פון די ציל דזשין און די ינערלעך רעפֿערענץ דזשין.

טעכניש יבערכאַזערונג
נעמען די פעפער באהאנדלט מיט פּעסטאַסיידז ווי אַ בייַשפּיל ווידער.פֿאַר די יקספּערמענאַל גרופּע פון ​​פאַבריק א, מיר געמאכט דריי פּקר האָלעס פון 1, 2 און 3 פֿאַר זיין ציל דזשין און ינערלעך רעפֿערענץ דזשין ריספּעקטיוולי, אַזוי צו נעמען די דורכשניטלעך נאָך די דיטעקשאַן.פֿאַר די קאָנטראָל פון פאַבריק א גרופּעס זענען אויך באהאנדלט אין די זעלבע וועג.סימילאַרלי טאָן די זעלבע באַהאַנדלונג פֿאַר ב און C געוויקסן.דאָס איז טעכניש יבערכאַזערונג.

עס איז כדאי צו באמערקן אַזוואָס קומט אריין אין די סטאַטיסטיק איז די בייאַלאַדזשיקאַל יבערכאַזערונג, און די טעכניש יבערכאַזערונג איז צו פּרובירן צי עס זענען קיין טראַפ - דערשיינונגען אין די יקספּערמענאַל פּראָצעס, אַזוי צו מאַכן די יקספּערמענאַל רעזולטאַטן קרעדאַבאַל, דאָס איז, צו ויסמיידן ערראָרס דורך נעמען זייער דורכשניטלעך ווי מיר אָפט זאָגן.

נעגאַטיוו קאָנטראָלס - NTC און NRT
NTC (ניט-טעמפּאַטע קאָנטראָל), אַ קאָנטראָל אָן אַ מוסטער, איז געניצט צו באַשטעטיקן צי די יקספּערמענאַל מאַטעריאַל איז קאַנטאַמאַנייטאַד.אין אַלגעמיין, וואַסער איז געניצט ווי אַ מוסטער.אויב עס איז אַ פלורעסאַנט אָפּרוף, עס ינדיקייץ אַז נוקלעיק זויער קאַנטאַמאַניישאַן איז פארגעקומען אין דער לאַבאָראַטאָריע.

די פאַרפּעסטיקונג קומען פון: ומריין וואַסער, אַנקוואַלאַפייד ריידזשאַנץ מיט ענדאָגענאָוס דנאַ, אָנפאַנגער פאַרפּעסטיקונג, לאַבאָראַטאָריע עקוויפּמענט פאַרפּעסטיקונג, אַעראָסאָל פאַרפּעסטיקונג, אאז"ו ו, דאַרפֿן צו נוצן רנאַסע סקאַוואַנדזשערז און רנאַסע ינכיבאַטערז.אַעראָסאָל פאַרפּעסטיקונג איז די מערסט שווער צו געפֿינען.ימאַדזשאַן דיין לאַבאָראַטאָריע איז ווי סמאָג, מיט פאַרשידן נוקלעיק אַסאַדז סוספּענדעד אין די לופט.

NRT (ניט-פאַרקערט טראַנסקריפּציע), די קאָנטראָל אָן פאַרקערט טראַנסקריפּציע, איז די ניט-פאַרקערט טראַנסקריבעד רנאַ ווי אַ נעגאַטיוו קאָנטראָל, וואָס איז די קאָנטראָל פון גדנאַ רעזאַדו.

ווען איר טאָן דזשין אויסדרוק, די סומע פון ​​רנאַ איז דיטעקטאַד דורך דיטעקטינג די סומע פון ​​​​cDNA נאָך פאַרקערט טראַנסקריפּציע.אויב עס איז גדנאַ רעזאַדו ווען רנאַ איז פּיוראַפייד, דאָס וועט פאַרשאַפן ערראָרס אין די יקספּערמענאַל רעזולטאַטן, ווייַל די פאַקטיש רעזולטאַטן זענען גדנאַ און cDNA.אין די געמיינזאַם מדרגה, ניט נאָר cDNA, gDNA דאַרף זיין גאָר אַוועקגענומען בעשאַס רנאַ יקסטראַקשאַן.

MIQE (2) - מוסטער אינפֿאָרמאַציע
די אַזוי גערופענע מוסטער אינפֿאָרמאַציע מיטל אַז ווען מיר אַרויסגעבן אַן אַרטיקל וועגן qPCR, מיר מוזן דערקלערן די מוסטער אינפֿאָרמאַציע קלאר, וואָס איז אַ ינדיספּענסאַבאַל טייל פון דעם אַרטיקל.סימילאַרלי, ווען מיר פּראָצעס סאַמפּאַלז, מיר מוזן אויך רעגולירן אונדזער אייגענע אַפּעריישאַנז צו ענשור די גילטיקייַט פון די סאַמפּאַלז.

די באַשרייַבונג פון די מוסטער איז בלויז אַ רעזולטאַט, און מיר זאָל באַצאָלן מער ופמערקזאַמקייַט צו די מאַטעריאַלס גענומען בעשאַס די גאנצע עקספּערימענט.

סעלעקציע פון ​​יקספּערמענאַל מאַטעריאַלס
בלוט סאַמפּאַלז - קלייַבן פריש בלוט, ניט מער ווי 4 שעה.צעל סאַמפּאַלז - קלייַבן צו זאַמלען פריש סעלז אין אַ צייט פון קראַפטיק וווּקס.כייַע געוועב - קלייַבן פריש, וויגעראַסלי גראָוינג געוועב.פּלאַנט געוועב - קלייַבן פריש, יונג געוועב.

איר האָט זיכער באמערקט אַז עס איז אַ שליסל וואָרט אין די ביסל זאצן: פריש .
פֿאַר די אויבן סאַמפּאַלז, דער בעסטער, פּרייַז-עפעקטיוו און סטאַביל קיט אויף די מאַרק איז פאָרעגענע ס קיט, וואָס קענען געשווינד און לייכט עקסטראַקט זייער דנאַ און רנאַ.

בלוט דנאַ מיני קיט

צעל גאַנץ רנאַ אפגעזונדערטקייט קיט

כייַע גאַנץ רנאַ אפגעזונדערטקייט קיט

פּלאַנט גאַנץ רנאַ אפגעזונדערטקייט קיט

פּלאַנט גאַנץ רנאַ אפגעזונדערטקייט קיט פּלוס

פּלאַנט דנאַ אפגעזונדערטקייט קיט

סטאָרידזש פון יקספּערמענאַל מאַטעריאַלס
אין אַלגעמיין, מיר טאָן נישט רעקאָמענדירן סטאָרינג סאַמפּאַלז אויב די באדינגונגען לאָזן.אָבער, עס זענען פילע פריינט וואָס קענען נישט דורכפירן יקספּעראַמאַנץ מיד נאָך מוסטערונג, און עטלעכע אפילו דאַרפֿן צו פירן פליסיק ניטראָגען טאַנגקס צו די פעלד פֿאַר מוסטערונג.

פֿאַר דעם מין פון שווער-ארבעטן פרייַנד, איך קען נאָר זאָגן אַז איר טאָן ניט פֿאַרשטיין רעאַגענט קאָנסומאַבלעס.איצט פילע רייידזשאַנט קאָנסומאַבלע קאָמפּאַניעס פּראָדוצירן רייידזשאַנץ וואָס קענען קראָם רנאַ סאַמפּאַלז אין צימער טעמפּעראַטור, און איר קענען קלייַבן צו נוצן זיי.די קאַנווענשאַנאַל סטאָרידזש אופֿן איז פליסיק ניטראָגען סטאָרידזש, ניצן אַ קליין פליסיק ניטראָגען טאַנק וואָס איז גרינג צו פירן.נאָך ברענגען די מוסטער צוריק צו דער לאַבאָראַטאָריע, קראָם עס אין אַ -80 ° C פרידזשידער.

פֿאַר יקספּעראַמאַנץ מיט רנאַ, די זעקס-וואָרט פּרינציפּ מוזן זיין נאכגעגאנגען:נידעריק טעמפּעראַטור, קיין ענזימעס,אוןשנעל .

דער באַגריף פון נידעריק טעמפּעראַטור איז גרינג צו פֿאַרשטיין;אָן ענזימעס, רנאַסע איז אומעטום אין דער וועלט מיר לעבן אין (אַנדערש איר וואָלט האָבן שוין געהרגעט דורך היוו), אַזוי ווי צו ויסמיידן רנאַסע ווען טאן יקספּעראַמאַנץ איז אַ זייער וויכטיק באַגריף;שנעל,עס איז קיין קאַנג פו אין דער וועלט וואָס קענען ניט זיין צעבראכן, נאָר גיכקייַט קענען ניט זיין צעבראכן.

דעריבער, אין אַ זינען, די קירצער די יקסטראַקשאַן צייַט, די בעסער די קיט.פארוואס טוטפאָרעגענעס קיט ונטערשטרייַכן גיכקייַט, ווייַל זיי וויסן עס געזונט.

פּס: עטלעכע גערלז טאָן יקספּעראַמאַנץ זייער קערפאַלי, אָבער זיי זענען נישט אַזוי גוט ווי אַ סלאַם דונק נאָך עטלעכע יאָרן פון אַרבעט.זיי פילן אַז גאָט איז ומיוישערדיק, קאַמפּליינינג וועגן אנדערע, און קוקן פֿאַר לעבן.למעשה האט זי עס נישט פארשטאנען.ער האט נישט גוט באשיצט די רנא, און דער סלאם דונק שפּילער איז געווען פלינק.ווען ער האָט געטאָן דעם עקספּערימענט, האָט ער געמאַכט, אַז ער וועט ענדיקן דעם סלאַם דונק מיט דרײַ מאָל, פֿינף מאָל און צוויי אָפּטיילן, אָבער ער האָט גוט דורכגעפֿירט דעם עקספּערימענט.

נאטיץ: סלאָוער, מער גיכער פון רנאַסע ינוואַזיע.ווי צו באַן זיך צו זיין שנעל?עס איז קיין וועג, נאָר פיר מער.

פֿאַר פאַרשידענע יקספּעראַמאַנץ און פאַרשידענע סאַמפּאַלז, עס איז נאָך נייטיק צו לייענען מער ליטעראַטור און קלייַבן אַ צונעמען אופֿן פֿאַר פּראַסעסינג.פֿאַר די מוסטער זאַמלונג און סטאָרידזש פּראָצעס, MIQE ריקווייערז אַז עס מוזן זיין קלאר געשריבן אין די פּאַפּיר, אַזוי אַז די ריוויוערז קענען אָפּשאַצן די רילייאַבילאַטי פון די פּאַפּיר, און עס איז אויך באַקוועם פֿאַר די סטאַנד יאָונגסטערס צו איבערחזרן דיין עקספּערימענט.

כאָטש בייאַלאַדזשיקאַל יקספּעראַמאַנץ זענען שווער, זיי זענען הויך-סוף.אויב איר זענט נישט אָפּגעהיט, איר קענען יבערקערן די וועלט.פֿאַר בייַשפּיל, מאַכן סאַרס אין אַ בייאָוקעמיקאַל קריזיס, אָדער מאַכן כייבריד רייַז צו ראַטעווען 1.3 ביליאָן מענטשן.די בילד אונטן איז אַ כעמישער עקספּערימענט, איר זאָל פֿאַרשטיין ווי שטאָלץ איר זענט פון דיין פאָרשונג נאָר דורך קוקן אין זיין דיק-ווי אויסזען.פארגעסן, שװארץ אים נישט.

MIQE (3) - נוקלעיק זויער יקסטראַקשאַן.
נוקלעיק זויער יקסטראַקשאַן איז אַ גרויס געשעעניש, און אַלע מאָלעקולאַר ביאָלאָגי יקספּעראַמאַנץ אָנהייבן מיט נוקלעיק זויער יקסטראַקשאַן.ערשטער פון אַלע, לאָזן אונדז נאָכמאַכן די אינהאַלט פון MIQE אויף נוקלעיק זויער יקסטראַקשאַן.

קוקן אין דעם פאָרעם, איר קענען נישט בלייַבן אויף די ייבערפלאַך.די פאָרעם איז אַ דאָגמאַ.צו זיין אַ שפּיץ תּלמיד, איר מוזן פרעגן וואָס.דער יקערדיק אינהאַלט פון דעם טיש איז: נאָכגייןדי ריינקייַט, אָרנטלעכקייַט, קאָנסיסטענסי, און יקסטראַקשאַן סומע פון ​​רנאַ .

דער ערשטער טייל פון די יופּראָצעס אָדער קיילע איז די נוקלעיק זויער יקסטראַקשאַן שריט.אויב איר נוצן אַן אָטאַמאַטיק נוקלעיק זויער עקסטראַקטאָר (אַוואַנסירטע, ביטע קאָנטאַקט מיר פֿאַר קויפן), איר דאַרפֿן צו אָנווייַזן די מאָדעל נאָמען פון די קיילע.

דער נאָמען פון די קיט און

וואָס ינווענטאַר איז געניצט פֿאַר די ענדערונג דעטאַילס, וואָס ספּעציעל רייידזשאַנץ זענען צוגעגעבן אָדער וואָס ספּעציעל אַפּעריישאַנז זענען געטאן זאָל זיין דערקלערט קלאר אַזוי אַז אנדערע קענען לייכט איבערחזרן דיין עקספּערימענט.

עטלעכע מענטשן לייגן עטלעכע ספּעציעל רייידזשאַנץ ווען יקסטראַקטינג ספּעציעל סאַמפּאַלז, טראכטן אַז דאָס איז זייער סוד וואָפן און טאָן ניט זאָגן אנדערע.בשעת זיי האַלטן עס סוד, זיי אויך פאַרלירן די געלעגנהייט צו מאַכן דיין אַרטיקל שייַנען.דו זאלסט נישט זיין קלוג, איר מוזן זיין מער ערלעך ווי די לאַנד אַלט זשאַנג אין וויסנשאפטלעכע פאָרשונג, אויב איר ווילן צו זיין קלוג, דער אַרטיקל וועט מאַכן איר נאַריש.

מוזן געדענקען די פּראָדוקט נומער פון די קיטווען איר סדר די קיט און שרייַבן דעם אַרטיקל.עס זענען בכלל צוויי נומערן אויף די קיט: קאַט - קאַטאַלאָג נומער (פּראָדוקט נומער, אַרטיקל נומער), פּלאַץ - פּראָדוקט פּלאַץ נומער (געניצט צו אָנווייַזן פון וואָס פּעקל די פּראָדוקט געקומען פון).

אין אַדישאַן, די CAS נומער איז אָפט געניצט ווען אָרדערינג בייאָוקעמיקאַל רייידזשאַנץ, און איך וועל פּאָפּולערייז עס צוזאַמען.די CAS נומער איז די נומער געגעבן דורך די אמעריקאנער כעמישער געזעלשאפט צו יעדער נייַ כעמישער מעדיצין.אין אַלגעמיין, דרייַ נומערן זענען פארבונדן דורך אַ לאָך.Rushui's CAS נומער: 7732-18-5.קעמיקאַלז אָפט האָבן קייפל ייליאַסיז, ​​אָבער די CAS נומער איז יינציק.ווען איר אָרדערינג מעדיצין, איר קענט ערשטער קאָנטראָלירן די CAS נומער.

נעענטער צו שטוב, פארוואס דארפן מיר קלאר באשרייבן די זאכן?אין פאַקט, עס איז אויך צו קאָנטראָלירן די קוואַליטעט פון רנאַ יקסטראַקשאַן.די נוצן פון ינסטראַמאַנץ און קיץ וועט מאַכן רנאַ יקסטראַקשאַן מער קאָנסיסטענט.די יקסטראַקשאַן וואָג פון פּראָסט לאַבאָראַטאָריעס איז נישט גרויס, און עס קענען זיין באקומען מיט קיץ.

די דעטאַילס פון DNase אָדער RNase באַהאַנדלונג
די וויכטיק אַרויסגעבן פון פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר איז צו פאַרמייַדן דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן, און טאָן ניט עקספּערימענט אויב עס איז קאַנטאַמאַניישאַן.דעריבער, עס איז ימפּעראַטיוו צו זאָגן דעם פּראָצעס איר געוויינט צו פּראַסעסינג די דנאַ, אין סדר צו באַווייַזן אַז די דנאַ אין די יקספּערמענאַל פּראָצעס איז גאָר און גאָר אַוועקגענומען.רעפּריזענטיד דורך אַ סכעמאַטיש דיאַגראַמע.

סכעמאַטיש דיאַגראַמע פון ​​רנאַ און דנאַ
אין אַלגעמיין, דער אופֿן פֿאַר רימוווינג דנאַ איז צו מייַכל רנאַ מיט דנאַסע נאָך יקסטראַקשאַן.אָבער, דאָס זענען לעפיערעך אַלט מעטהאָדס.געשעפט רנאַ יקסטראַקשאַן קיץ האָבן שוין קענען צו באַזייַטיקן דנאַ בעשאַס די יקסטראַקשאַן פּראָצעס אָן אַדינג דנאַסע.פֿאַר בייַשפּיל, אַ סעריע פון ​​קיץ פון Foregene.

נאטיץ: רימוווינג דנאַ בעשאַס רנאַ יקסטראַקשאַן איז אַ זייער געפערלעך טאָפּל-שנלדיקע שווערד, וואָס וועט פאַרלענגערן די אָפּעראַציע צייט פון רנאַ יקסטראַקשאַן און פאַרגרעסערן די ריזיקירן פון רנאַ דערנידעריקונג.בייסיקלי, עס איז אַ האַנדל-אַוועק צווישן רנאַ טראָגן און ריינקייַט.

אין אַדישאַן, די סומע פון ​​​​דנאַסע צוגעגעבן צו די סיליקאַ-באזירט אַדסאָרפּטיאָן זייַל איז זייער קליין, און הויך-קוואַליטעט דנאַסע מוזן זיין געוויינט צו דערגרייכן די ווירקונג.ונאָפּטימיזעד דנאַסע קענען ניט זיין דיידזשעסטיד געשווינד און גאָר.דאָס איז אַ פּראָבע פון ​​די טעכניש מדרגה פון די סוחר.פון קורס, עס זענען אפילו מער מאָדנע סוחרים וואָס באַרימערייַ אַז דנאַ קענען זיין אַוועקגענומען אָן דנאַס.מע קאָן זאָגן, אַז דער, וואָס באַרימט זיך, אַז דנאַ קען מען גאָר אַוועקנעמען אָן דנאַסע, איז אַ כוליגאַן.דנאַ איז אַ לעפיערעך סטאַביל טאָפּל-סטראַנדיד סטרוקטור, און עס קענען ניט זיין אפגעווישט נאָר דורך גערעדט און לאַפינג.

קאַנטאַמאַניישאַן אַסעסמאַנט
אַסעסמאַנט אופֿן: עלעקטראָפאָרעסיס דיטעקשאַן, 1% אַגאַראָסע, 6V/cm, 15min, לאָודינג 1-3 UL

קוואַנטיטאַטיווע אַנאַליסיס פון נוקלעיק זויער
איז יוזשאַוואַלי געמאסטן ניצן אַ UV ספּעקטראָפאָטאָמעטער.לאָזן מיר ערשטער פּאָפּולאַריזירן די טייַטש פון די דריי וואַלועס פון OD260, OD280 און OD230.
· OD260nm: עס איז די אַבזאָרפּשאַן ווייוולענגט פון די העכסטן אַבזאָרפּשאַן שפּיץ פון נוקלעיק זויער, און דער בעסטער געמאסטן ווערט ריינדזשאַז פון 0.1 צו 1.0.אויב ניט, צעפירן אָדער קאַנסאַנטרייט די מוסטער צו ברענגען עס אין די קייט.
· OD280nm: עס איז די אַבזאָרפּשאַן ווייוולענגט פון די העכסטן אַבזאָרפּשאַן שפּיץ פון פּראָטעין און פענאָליק סאַבסטאַנסיז.
· OD230nm: עס איז די אַבזאָרפּשאַן ווייוולענגט פון די העכסטן אַבזאָרפּשאַן שפּיץ פון קאַרבאָוכיידרייץ.

ווייַטער, לאָזן ס רעדן וועגן די ראָלע פון ​​יעדער גראדן.פֿאַר A260, עס קענען זיין געוויינט צו מעסטן די טראָגן פון נוקלעיק זויער.ווען OD260 = 1, דסדנאַ = 50μג/מל, ססדנאַ = 37μג/מל, רנאַ = 40μג/מל.

פֿאַר ריינקייַט, מיר דאַרפֿן צו קוקן אין די ריישיאָוז וואָס מיר אָפט זען: OD260/280 און OD260/230.
· ריין דנאַ: OD260/280 איז בעערעך גלייַך צו 1.8.ווען עס איז גרעסער ווי 1.9, עס ינדיקייץ אַז עס איז רנאַ פאַרפּעסטיקונג, און ווען עס איז ווייניקער ווי 1.6, עס ינדיקייץ אַז עס איז פּראָטעינס און פענאָל פאַרפּעסטיקונג.
· ריין רנאַ: 1.7
·OD260/230: צי עס איז דנאַ אָדער רנאַ, די רעפֿערענץ ווערט איז 2.5.ווען עס איז ווייניקער ווי 2.0, עס ינדיקייץ אַז עס איז פאַרפּעסטיקונג פון צוקער, זאַלץ און אָרגאַניק ענין.

רנאַ אָרנטלעכקייַט

עס איז זייער וויכטיק צו מעסטן די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ.אין אַלגעמיין, עס איז נייטיק צו טאָן אַן עקספּערימענט פון רנאַ דענאַטוראַטיאָן געל צו קאָנטראָלירן צי די ברייטנאַס צווישן 28S און 18S רנאַ איז אַ צוויי-פאַרלייגן שייכות.ווען דער דריטער באַנד 5S איז ארויס, עס מיטל אַז די רנאַ האט אנגעהויבן צו דיגרייד, אַחוץ פֿאַר ינווערטאַברייץ.

דאַטן פֿאַר RNA קוואַליטעט אַססעססמענט: אין אַדישאַן צו די אויבן טעסץ, עס זענען אויך עטלעכע מער אַוואַנסירטע ינסטרומענט טעסץ אין טערמינען פון רנאַ אָרנטלעכקייַט, אַזאַ ווי די RQI אָרנטלעכקייַט פּראָבע פון ​​די עקספּעריאָן אָטאַמאַטיק עלעקטראָפאָרעסיס סיסטעם, וואָס קענען דעטעקט צי רנאַ איז דיגריידיד ומזעיק.

אין וויסנשאפטלעכע פאָרשונג, פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר איז אַ פאַרגלייַך צווישן די ציל דזשין און די ינערלעך רעפֿערענץ דזשין.דעריבער, אין דעם פּראָצעס פון פּראַזערוויישאַן פון רנאַ מוסטער, רנאַ יקסטראַקשאַן, אאז"ו ו, די ערשטיק ציל איז צו ענשור די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ.

ווי די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ אַפעקץ די וואָג צווישן די ציל דזשין און די ינערלעך רעפֿערענץ דזשין קענען זיין לייכט פארשטאנען פֿון די פיגור אונטן.דערנידעריקונג וועט פירן צו דזשין ינקאָמפּלעטענעסס, צי עס איז די ינקאָמפּלעטענעסס פון די ינערלעך רעפֿערענץ דזשין אָדער די ינקאָמפּלעטענעסס פון די ציל דזשין, עס וועט האָבן אַ גרויס פּראַל אויף די דאַטן.

סכעמאַטיש דיאַגראַמע פון ​​ציל דזשין און רעפֿערענץ דזשין מוזן נישט זיין אמת

ינאַבישאַן פּרובירן (צי די קאָרט ווערט איז סאַפּרעסט אונטער הויך אָדער נידעריק קאַנסאַנטריישאַן אָדער אנדערע באדינגונגען)

גענומען דעם פיגור ווי אַ בייַשפּיל, די Ct וואַלועס פון די פינף קורוועס זענען ווי גייט.די פאַרשפּרייטונג פון CT וואַלועס צווישן די קורוועס איז אַניוואַן, און די Ct וואַלועס זענען דילייד אונטער הויך און נידעריק קאַנסאַנטריישאַנז, וואָס איז דער פאַל פון פּקר ינאַבישאַן.

שליסל פונט: אין דעם פּראָצעס פון רנאַ יקסטראַקשאַן, מיר דאַרפֿן צו פאַרלאָזן מיסקאַנסעפּשאַנז און פאַרלייגן ריכטיק אָנעס.

דער אומרעכט געדאַנק איז: רנאַ יקסטראַקשאַן נאָר פּערסוז די טראָגן, טראכטן אַז די גרעסערע די סומע פון ​​רנאַ באקומען, די בעסער.אין פאַקט, ווען מיר טאָן קוואַנטיפיקאַטיאָן, אויב די נומער פון גענעס איז נישט זייער גרויס, מיר טאָן ניט דאַרפֿן פיל רנאַ.די סומע פון ​​רנאַ איר עקסטראַקט איז מער ווי גענוג.

דער ריכטיקער באַגריף איז:רנאַ יקסטראַקשאַן זאָל נאָכגיין ריינקייַט, אָרנטלעכקייַט און קאָנסיסטענסי.ריינקייַט קענען ענשור אַז די סאַבסאַקוואַנט פאַרקערט טראַנסקריפּציע איז נישט ינכיבאַטיד און די דאַטן וועט נישט זיין אַפעקטאַד דורך דנאַ.אָרנטלעכקייַט ינשורז די וואָג פון ציל סיקוואַנסיז און ינערלעך באַווייַזן.קאָנסיסטענסי ינשורז סטאַביל מוסטער לאָודינג.

MIQE (4) - פאַרקערט טראַנסקריפּציע
מיסקאַנסעפּשאַן: די יאָג פון העכער מוסטער באַנד.
ריכטיק באַגריף: נאָכגיין קאָנסיסטענסי (סטאַביליטי), ראַגאַרדלאַס פון די סומע פון ​​​​רנאַ לאָודיד, די עפעקטיווקייַט פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע בלייבט קאָנסיסטענט, ינשורינג אַז דיפעראַנסיז אין cDNA קענען טאַקע פאַרטראַכטנ דיפעראַנסיז אין מרנאַ.
מיר דערקלערן דעם פּראָצעס מיט אַ סכעמאַטיש דיאַגראַמע:

סכעמאַטיש דיאַגראַמע פון ​​פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט, טאָן ניט זיין אמת
ערשטער פון אַלע, מיר דאַרפֿן צו פֿאַרשטיין די חילוק צווישן די פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּראָצעס און די פּקר פּראָצעס.פּקר אַנדערגאָוז קייפל באַהיצונג און אַנילינג פּראַסעסאַז, און דער ציל פראַגמענט וואקסט עקספּאָונענשאַלי;כאָטש פאַרקערט טראַנסקריפּציע טוט נישט האָבן דעם פּראָצעס, מיר קענען ימאַדזשאַן אַז פאַרקערט טראַנסקריפּציע איז אַקשלי איין-צו-איינער בעשאַס די רעפּלאַקיישאַן פּראָצעס, ווי פילע טיילן פון רנאַ

ווי עס קענען באַקומען ווי פילע שטיק פון cDNA אינפֿאָרמאַציע, עס זאָל זיין פארשטאנען איצט, ווייַל פראַגמאַנץ גרויס און קליין האָבן שוין פאַרקערט טראַנסקריבעד, און עס איז אוממעגלעך צו פאָקוס אויף איין פראַגמענט.און ווייַל די סומע פון ​​רנאַ איז לעפיערעך קליין, די סומע פון ​​​​קדנאַ באקומען איז אויך לעפיערעך קליין, ניט ענלעך PCR, וואָס האט אַ אַמפּלאַפאַקיישאַן ווירקונג, אַזוי עס איז בייסיקלי אוממעגלעך צו דעטעקט.

רעזולטאטן פון cDNA עלעקטראָפאָרעסיס
צווייטנס, יידילי, פאַרקערט טראַנסקריפּציע איז געטאן איינער-צו-איינער, אָבער קיין פאַרקערט טראַנסקריפּציע פון ​​קיין פירמע קענען דערגרייכן דעם ווירקונג.בייסיקלי, די עפעקטיווקייַט פון רובֿ פאַרקערט טראַנסקריפּץ וואַנדערז צווישן 30-50%.אויב דאָס איז דער פאַל, מיר וועלן אלא האָבן אַ לעפיערעך סטאַביל פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט, וואָס איז וואָס מיר ווילן צו זען אין די פיגור: 3 רנאַ באַקומען 2 cDNAs, 6 RNAs באַקומען 4 cDNAs, אַזוי קיין ענין ווי פיל מוסטער איז לאָודיד, די פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט איז לעפיערעך סטאַביל.מיר טאָן נישט וועלן צו זען די סיטואַציע ווו די פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט איז אַנסטייבאַל און הויך קאַנסאַנטריישאַן איז ינכיבאַטיד.

אַזוי, ווי צו באַשטעטיקן צי די פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט איז סטאַביל?דער אופֿן איז זייער פּשוט, איר נאָר דאַרפֿן צו טאָן אַ פאַרגלייַך פּרובירן: איינער איז צו פאַרקערט טראַנסקריבירן אין cDNA נאָך דאַבלינג דיילושאַן פון רנאַ, און די אנדערע איז צו מאַכן דאַבלינג דיילושאַן נאָך פאַרקערט טראַנסקריבינג אין cDNA, און דאַן טאָן qPCR צו זען די שיפּוע איז קאָנסיסטענט.ווי אַ שפּיץ תּלמיד, איר זאָל פֿאַרשטיין עס אין סעקונדעס.ווי געוויזן אונטן:

דילוטיאָן פון רנאַ און cDNA צו פּרובירן צי די עפעקטיווקייַט פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע איז סטאַביל
פאַרקערט טראַנסקריפּציע און קיט
ווי קענען שליימעסדיק פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר האָבן ויסגעצייכנט פאַרקערט טראַנסקריפּציע און קיט.פאַרקערט טראַנסקריפּציע איז בעערעך צעטיילט אין צוויי טייפּס לויט די מקור, AMV אָדערM-MLV, און זייער פאָרשטעלונג איז די זעלבע ווי די געוויזן אין די טיש.

RNase H טעטיקייט
רנאַסע ה איז ריבאָנוקלאַסע ה, די כינעזיש נאָמען איז ריבאָנוקלאַסע ה, וואָס איז אַן ענדאָריבאָנוקלאַסע וואָס קענען ספּאַסיפיקלי כיידראַלייזד רנאַ אין די דנאַ-רנאַ כייבריד קייט.רנאַסע ה קען נישט כיידראַליזירן די פאָספאָדיעסטער קייטן אין איין-סטראַנדיד אָדער טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ אָדער רנאַ, דאָס איז, עס קען נישט דיידזשעסטיד איין-סטראַנדיד אָדער טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ אָדער רנאַ.קאַמאַנלי געניצט אין דער סינטעז פון די רגע שנירל פון קדנאַ.

עס איז אַ מאָדנע זאַך.מיר זאָגן אַז פאַרקערט טראַנסקריפּציע האט RNase H טעטיקייט, נישט אַז פאַרקערט טראַנסקריפּציע כּולל RNase H, און עס קען נישט זיין מעגלעך צו באַזונדער RNase H פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע, טאָמער ווייַל פון די קאַנפאָרמיישאַן פון זיכער גרופּעס אין פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע.

דעריבער, ראַגאַרדלאַס פון די העכער פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט פון AMV, זייַן RNase H טעטיקייט ראַדוסאַז די טראָגן פון cDNA.דאָך, רייידזשאַנט מאַניאַפאַקטשערערז קעסיידער אָפּטימיזירן זייער פּראָדוקטן צו עלימינירן RNase H טעטיקייט אין פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע ווי פיל ווי מעגלעך צו פאַרגרעסערן די טראָגן פון cDNA.
אַנילינג טעמפּעראַטור

צווייטיק סטרוקטור פון רנאַ אין פאַרשידענע טעמפּעראַטורעס
זען די פיגור אויבן פֿאַר די צווייטיק סטרוקטור פון רנאַ ביי פאַרשידענע טעמפּעראַטורעס, און נוצן די mFold אָנליין געצייַג צו באַשטימען די צווייטיק סטרוקטור פון די ציל פראַגמענט אונטער ספּעציפיש טעמפּעראַטור און זאַלץ קאַנסאַנטריישאַן טנאָים.ביי 55 ° C, די צווייטיק סטרוקטור פון די רנאַ איז נאָך זייער קאָמפּליצירט, פאַרקערט טראַנסקריפּציע קען נישט אַרבעטן, און די צווייטיק סטרוקטור קענען ניט זיין גאָר ריזאַלווד ביז 65 ° C, בשעת די אָפּטימום טעמפּעראַטור פון AMV און M-MLV איז פיל נידעריקער ווי די טעמפּעראַטור.
וואָס צו טאָן?די צווייטיק סטרוקטור איז די קאַמפּלאַמענטשי פּערינג פון די מוסטער זיך, וואָס פירט צו שטאַרק פאַרמעסט צווישן די אָנפאַנגער און פאַרקערט טראַנסקריפּציע און די מוסטער, ריזאַלטינג אין אַ סעריע פון ​​פּראָבלעמס אַזאַ ווי נידעריק E און נעבעך ריפּיטאַביליטי.

וואָס צו טאָן?נאָר פאַרגרעסערן די אַנילינג טעמפּעראַטור ווי פיל ווי מעגלעך.

פילע רייידזשאַנט מאַניאַפאַקטשערערז פֿאַרבעסערן זייער פאַרקערט טראַנסקריפּציע דורך גענעטיק ינזשעניעריע.עטלעכע פאַרגרעסערן די אָפּרוף טעמפּעראַטור, אַזאַ ווי Jifan און Aidelai, און עטלעכע באַזייַטיקן די אַקטיוו גרופּע פון ​​רנאַסע ה ענזיים צו פֿאַרבעסערן די קירבות צווישן די ענזיים און די רנאַ מוסטער.הויך קירבות קענען קאַמפּעטיטיוו קוועטשן די צווייטיק סטרוקטור און לייענען סמודלי, און אויך שטארק פֿאַרבעסערן די עפעקטיווקייַט פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע.
שליסל פונט: פאַרקערט טראַנסקריפּציע איז מער וויכטיק צו נאָכגיין די קאָנסיסטענסי פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט (ענזימעס מוזן נישט בלויז זיין עפעקטיוו אָבער אויך סטאַביל), אלא ווי די סומע פון ​​​​לאָודיד מוסטער, אויב עס איז נישט אַ ספּעציעל גרויס-וואָג פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר, עס וועט נישט זיין מעגלעך.קייפל cDNAs.
פאַרשידן מאַניאַפאַקטשערערז האָבן אויך געמאכט עטלעכע השתדלות אין די יאָג פון קאָנסיסטענסי.פֿאַר בייַשפּיל, רובֿ קאָמפּאַניעס האָבן איצט פּאַקידזשד פאַרקערט טראַנסקריפּציע ווי אַ נאָרמאַל ינווענטאַר פֿאַר פאַרקויף, וואָס איז אַ גוט ברירה.
פֿאַר בייַשפּיל, Foregene's RT Easy Series קיץ:

RT Easy I (האר פּרעמיקס פֿאַר ערשטער שנירל קדנאַ סינטעז קיט)

MIQE (5) - ציל דזשין אינפֿאָרמאַציע

די אויבן פיגור דערקלערט
1. צי דעם דזשין איז עפעקטיוו פֿאַר ריפּיטיד יקספּעראַמאַנץ קענען בכלל זיין וועראַפייד דורך ריפּיטיד יקספּעראַמאַנץ.
2. Gene ID, איר וויסן.
3. דזשין לענג, די גאַנץ לענג פון די ציל דזשין איז באשטימט קיין פּראָבלעם.ווען דיזיינינג אָנפאַנגער, ענשור אַז די לענג פון די אַמפּליקאָן איז צווישן 80-200 בפּ צו ענשור אַ בעסער אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט.
4. סיקוואַנס בלאַסט פאַרגלייַך אינפֿאָרמאַציע, דער ציל דזשין דאַרף זיין קאַמפּערד אין גענעבאַנק צו פאַרמייַדן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.
5. בייַזייַן פון פּסעוודאָגענעס.א פּסעודאָגענע איז אַ דנאַ סיקוואַנס ענלעך צו אַ נאָרמאַל דזשין אָבער פארלירט זייַן נאָרמאַל פונקציע.עס אָפט יגזיסץ אין די מאַלטי-דזשין משפּחה פון עוקאַריאָטעס.עס איז יוזשאַוואַלי רעפּריזענטיד דורך ψ.עס איז אַ ניט-פאַנגקשאַנאַל גענאָמיק דנאַ קאָפּיע אין די גענאָמע וואָס איז זייער ענלעך צו די קאָדירונג דזשין סיקוואַנס., זענען בכלל נישט טראַנסקריבירט, און האָבן קיין קלאָר פיזיאַלאַדזשיקאַל טייַטש.
6. שטעלע פון ​​פּרימערז קאָרעוו צו עקסאָנס און ינטראָנז.אין די פרי יאָרן, ווען מיר סאַלווד די פּראָבלעם פון דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן, מיר אָפט באַצאָלט ופמערקזאַמקייט צו די שטעלעס פון אָנפאַנגער, עקסאָנס און ינטראָנז, און בכלל געהאלטן דיזיינינג אָנפאַנגערס אַריבער ינטראָנס צו ויסמיידן דנאַ אַמפּלאַפאַקיישאַן.ביטע זען די פיגור אונטן: שוואַרץ רעפּראַזענץ ינטראָן, פאַרשידן בלוז רעפּראַזענץ עקסאָנס, ראָזעווע רעפּראַזענץ פּראָסט פּרימערז, און העל רויט רעפּראַזענץ ינטראָן-ספּאַנינג אָנפאַנגער.

סכעמאַטיש, קיינמאָל אמת
וואָס אַ שליימעסדיק פּלאַן דאָס מיינט, אָבער אין רובֿ פאלן, די טראַנס-ינטראָן פּרימערז זענען נישט ווי מאַדזשיקאַל ווי ימאַדזשאַנד, און זיי וועלן אויך פאַרשאַפן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.אַזוי דער בעסטער וועג צו פאַרמייַדן דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן איז צו באַזייַטיקן דנאַ גאָר.
7. קאָנפאָרמאַטיאָן פּראָגנאָז.ניצן דעם בייַשפּיל ווידער, נוצן די mFold אָנליין געצייַג צו באַשטימען די צווייטיק סטרוקטור פון די ציל פראַגמענט אין אַ ספּעציפיש טעמפּעראַטור און זאַלץ קאַנסאַנטריישאַן.

צווייטיק סטרוקטור פון רנאַ אין פאַרשידענע טעמפּעראַטורעס
די צווייטיק סטרוקטור איז די קאַמפּלאַמענטשי פּערינג פון די מוסטער זיך, וואָס וועט פירן צו שטאַרק פאַרמעסט צווישן די אָנפאַנגער און מוסטער פּערינג, און די גיכער פון אָנפאַנגער ביינדינג זענען ווייניקער, ריזאַלטינג אין אַ סעריע פון ​​​​פּראָבלעמען אַזאַ ווי נידעריק E און נעבעך ריפּיטאַביליטי.דורך ווייכווארג פּראָגנאָז, אויב עס איז קיין צווייטיק סטרוקטור פּראָבלעם, דאָס וואָלט זיין גרויס.אויב עס איז, אונדזער נאָכגיין-אַרויף אַרטיקל וועט ספּאַסיפיקלי דיסקוטירן ווי צו סאָלווע דעם פּראָבלעם.

MIQE (6) - qPCR אָליגאָנוקלעאָטידעס

פֿאַר פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר, דער ערשטער זאַך איר געראַנגל מיט יעדער טאָג איז רנאַ יקסטראַקשאַן, און די רגע זאַך קען זיין אָנפאַנגער פּלאַן.
ערשטער פון אַלע, מיר נאָך קאָנטראָלירן די כּללים וועגן אָנפאַנגער פּלאַן לויט די MIQE טשעקליסט.עס איז אַזוי פּשוט אַז די סקומבאַגז קענען לאַכן, און מיר קענען ענדיקן עס אין איין זאַץ: געפינען אויס די סיקוואַנס און שטעלע פון ​​די אָנפאַנגער זאָנד און די מאָדיפיקאַטיאָן אופֿן.פֿאַר די אָנפאַנגער רייניקונג אופֿן, אָנפאַנגער סינטעז איז דערווייַל אַזוי ביליק, qPCR איז ווערט פון PAGE און העכער רייניקונג מעטהאָדס, און די אינפֿאָרמאַציע פון ​​די סינטעז קיילע איז נישט וויכטיק.פילע מענטשן האָבן שוין טאן פּרימערז פֿאַר דעקאַדעס און טאָן ניט וויסן אַז די סינטאַסייזער איז ABI3900.
וועגן די פּרינסאַפּאַלז פון אָנפאַנגער פּלאַן, איר טאָן ניט האָבן צו מעמערייז זיי דורך רוץ, ווייַל רובֿ אָנפאַנגער פּלאַן ווייכווארג אָדער אָנליין מכשירים קענען נעמען קעיר פון די פּראָבלעמס (רעקאַמענדיד אָנליין געצייַג primer3.ut.ee/), און 99.999% פון אָנפאַנגער פּלאַן איז נישט מאַניואַלי.
נאָר קאָנטראָלירן די פאלגענדע פונקטן נאָך די פּרימערז זענען דיזיינד:
1. פּלאַן פּרימערז נאָענט צו די 3′ סוף: אין די פאַל פון ניצן oligo dT אָנפאַנגער פֿאַר cDNA ערשטער-שנירל סינטעז, קאַנסידערינג די פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט און רנאַ אָרנטלעכקייַט, די דיזיינד פּרימערז דאַרפֿן צו זיין דיזיינד נאָענט צו די 3′ סוף צו פֿאַרבעסערן אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט.ניצן אַ בילד צו דערקלערן ווי גייט (עס איז קיין וועג צו פֿאַרשטיין דעם):

פארוואס זאָל פּרימערז זיין דיזיינד נאָענט צו די 3′ סוף, עס מוזן נישט זיין אמת
2. טם ווערט: די טם ווערט איז ביי 55-65 ° C (ווייַל די עקסאָנוקלעאַס טעטיקייט איז די העכסטן ביי 60 ° C), און די גק אינהאַלט איז ביי 40% -60%.
3. בלאַסט: אין סדר צו ויסמיידן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן פון די גענאָמע, בלאַסט מוזן זיין געניצט פֿאַר סאַפּלאַמענערי וועראַפאַקיישאַן.

MIQE (7) - qPCR פּראָצעס

1. קפּקר קיט
לויט די רעקווירעמענץ פון MIQE, מיר מוזן קלאר באַשרייַבן די גאַנץ אָפּרוף טנאָים אין דעם אַרטיקל, אַרייַנגערעכנט די קאַנפיגיעריישאַן פון די PCR אָפּרוף סיסטעם, וואָס קיט איז געניצט, ווער איז דער פאַבריקאַנט, ווי גרויס איז די אָפּרוף סיסטעם, צי די פאַרב אופֿן אָדער די זאָנד אופֿן איז געניצט, פּקר פּראָגראַם סעטטינגס.וועטעראַן דריווערס וועט באשטימט געפֿינען אַז ווי לאַנג ווי די ינווענטאַר איז אויסגעקליבן, די אויבן אינפֿאָרמאַציע איז בייסיקלי באשלאסן.
דערווייַל, די פּראָדוצירן און פּראָדוקציע פון ​​פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר קיץ איז אַ זייער דערוואַקסן טעכנאָלאָגיע.ווי לאַנג ווי איר טאָן ניט קלייַבן גאָר שלעכט מאַניאַפאַקטשערערז, די מאַשמאָעס פון פּראָבלעמס איז נישט הויך, אָבער מיר נאָך ווילן צו טיילן מיט איר עטלעכע פונקטן:
הייס אָנהייב טאַק ענזיים:די מערסט וויכטיק טייל פון פּקר איז די הייס-אָנהייב טאַק ענזיים.די הייס-אָנהייב ענזימעס אויף דעם מאַרק זענען בכלל צעטיילט אין צוויי טייפּס, איינער איז אַ כעמיש מאַדאַפייד הייס-אָנהייב ענזיים (איר קענען ימאַדזשאַן עס ווי פּעראַפאַן עמבעדדינג), און די אנדערע איז אַ הייס-אָנהייב ענזיים פֿאַר אַנטיבאָדי מאָדיפיקאַטיאָן (אַנטיגען-אַנטיבאָדי ביינדינג).כעמישער מאָדיפיקאַטיאָן איז אַ פרי וועג פון הייס-סטאַרטינג ענזימעס.ווען אַ זיכער טעמפּעראַטור איז ריטשט, די ענזיים וועט מעלדונג זייַן טעטיקייט.די אַנטיבאָדי-מאַדאַפייד הייס-אָנהייב ענזיים ניצט בייאַלאַדזשיקאַל מעטהאָדס צו פאַרשפּאַרן די טעטיקייט פון די ענזיים.ווען אַ זיכער טעמפּעראַטור איז ריטשט, די אַנטיבאָדי וועט זיין דענאַטורעד און ינאַקטיווייטיד ווי אַ פּראָטעין, און די ענזיים טעטיקייט וועט זיין געבראכט אין שפּיל.

אָבער, וואָס איז די נוצן פון דעם?דאָס איז דער פאַל, די מעלדונג טעטיקייט פון אַנטיבאָדי-מאַדאַפייד ענזימעס איז פאַסטער ווי אַז פון כעמיש מאַדאַפייד ענזימעס, אַזוי אין טערמינען פון סענסיטיוויטי, אַנטיבאָדי-מאַדאַפייד ענזימעס האָבן אַ קליין מייַלע, אַזוי אַז עס זענען בייסיקלי קיין כעמיש מאַדאַפייד ענזימעס אין די קיץ אויף די מאַרק.אויב עס איז, די טעכנאָלאָגיע פון ​​דעם פאַבריקאַנט איז נאָך סטאַק אין די טקופע פון ​​די מיללענניום.
קאַנסאַנטריישאַן פון מאַגניזיאַם יאָן:מאַגניזיאַם יאָן קאַנסאַנטריישאַן איז זייער וויכטיק אין די פּקר אָפּרוף.די צונעמען קאַנסאַנטריישאַן פון מאַגניזיאַם יאָן קענען העכערן די מעלדונג פון טאַק ענזיים טעטיקייט.אויב די קאַנסאַנטריישאַן איז צו נידעריק, די ענזיים טעטיקייט וועט זיין באטייטיק רידוסט;אויב די קאַנסאַנטריישאַן איז צו הויך, די ענזיים-קאַטאַלייזד ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן וועט זיין ימפּרוווד.די קאַנסאַנטריישאַן פון מאַגניזיאַם ייאַנז וועט אויך ווירקן די אַנילינג פון פּרימערז, די מעלטינג טעמפּעראַטור פון די מוסטער און פּקר פּראָדוקטן, דערמיט אַפעקטינג די טראָגן פון אַמפּלאַפייד פראַגמאַנץ.די קאַנסאַנטריישאַן פון מאַגניזיאַם ייאַנז איז בכלל קאַנטראָולד ביי 25 מם.פון קורס, פֿאַר אַ גוט קיט, די קאַנסאַנטריישאַן פון מאַגניזיאַם ייאַנז מוזן זיין געזונט קאַנטראָולד.עטלעכע סוחרים לייגן אַ מאַגניזיאַם יאָן טשעלאַטינג אַגענט צו די רייידזשאַנט, וואָס קענען דערגרייכן די ווירקונג פון אָטאַמאַטיק אַדזשאַסטמאַנט פון די מאַגניזיאַם יאָן קאַנסאַנטריישאַן.
קאַנסאַנטריישאַן פון פלורעסאַנט פאַרב:פלואָרעססענט פאַרב, וואָס איז די SYBR גרין וואָס מיר יוזשאַוואַלי נוצן, דער הויפּט דזשענערייץ פלואָרעסענסע דורך בינדינג צו די מינערווערטיק נאָרע פון ​​טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ, ווייַל די בינדינג פון די פאַרב צו טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ איז ניט-ספּעציפיש, דאָס הייסט ווי לאַנג ווי טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ איז קאַמביינד מיט אים, פלואָרעסענסע קענען פּאַסירן, אַזוי עס וועט פאַרבינדן אָנפאַנגער-דימערז מיט אַ הינטערגרונט-דימערז און די סיסטעם.
פּס: רעכט צו זיין ליכט-שפּירעוודיק פּראָפּערטיעס, פּראָדוקטן אויף די מאַרק זענען בכלל פּאַקידזשד אין ברוין אָופּייק סענטריפודזש טובז (ווי געוויזן אין די בילד אונטן).אָבער, דאָס וועט טרעפן אַ פּראָבלעם.עס איז שווער צו זען צי די פליסיק איז סאַקט ווען מוסטערונג.אין דעם רעספּעקט, Qingke איז טאַקע די מערסט באַניצער-פרייַנדלעך (ווי געוויזן אין די בילד אונטן), און די טראַנספּעראַנט רער איז פּאַקידזשד אין אַ אָופּייק צין זעקל.דעריבער לייגן עס אין אַ צין זעקל, גענומען אין חשבון די קאַנוויניאַנס פון אַוווידינג ליכט און מוסטערונג.איר מוזן קלייַבן די רעכט פּראָדוקט נומער.TSE204 איז אַ סופּער פּרייַז-עפעקטיוו עקזיסטענץ, וואָס מאכט מיר וועלן צו פאַבריק גראָז.

די קאַנסאַנטריישאַן פון די פלורעסאַנט פאַרב איז אויך זייער וויכטיק.אויב די קאַנסאַנטריישאַן איז צו נידעריק, די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג וועט נישט גיין אַרויף אין די שפּעטער בינע און איז נישט גאנץ;אויב די קאַנסאַנטריישאַן איז צו הויך, דאָס וועט פאַרשאַפן ראַש ינטערפיראַנס.זינט די פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר דער הויפּט דעפּענדס אויף די קאָרט ווערט, אויב די קאַנסאַנטריישאַן פון די פלורעסאַנט פאַרב איז נישט אַדזשאַסטיד רעכט, די נידעריק פונט איז בעסער ווי די הויך פונט.פון קורס, די צונעמען פאַרב קאַנסאַנטריישאַן איז דער בעסטער.

ROX: ROX דיעס זענען געניצט צו ריכטיק פֿאַר געזונט-צו-געזונט פלואָרעססענסע סיגנאַל ערראָרס.עטלעכע מאַניאַפאַקטשערערז דאַרפן קאַלאַבריישאַן, בשעת אנדערע טאָן ניט.למשל, די נוצן פון Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR אַמפּלאַפאַקיישאַן ינסטרומענט יוזשאַוואַלי ריקווייערז קאַלאַבריישאַן, אַרייַנגערעכנט 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, אאז"ו ו.
Foregene's qPCR Mix אויך כּולל ROX פאַרב, וואָס איז באַקוועם פֿאַר נוצן אין פאַרשידן מאָדעלס.

פאַקטיש צייט פּקר קיט-טאַקמאַן

באַהאַנדלונג פון שוואַך הידראָגען בונד: די באַהאַנדלונג פון שוואַך הידראָגען קייטן איז אַ לעפיערעך טעכניש ענין.גאָרנישט האט לייענען די מאַניואַלז פון פילע קיץ, אָבער קיינער פון זיי דערמאנט דעם טעמע.אין פאַקט, עס איז אַזוי וויכטיק.די קאָמבינאַציע פון ​​באַסעס דעפּענדס דער הויפּט אויף די שטאַרקייט פון הידראָגען קייטן.שטאַרק הידראָגען קייטן זענען נאָרמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן, און שוואַך הידראָגען קייטן פירן צו ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.אויב שוואַך הידראָגען קייטן קענען ניט זיין ילימאַנייטאַד געזונט, ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן קענען ניט זיין אַוווידאַד.אין די פאַרנעם פון דעם מחבר, בלויז אַ ביסל קאָמפּאַניעס האָבן באמערקט דעם פּראָבלעם.ווען איר קויפן דעם קיט, איר קענט אָפּשיקן צו צי איר האָט באַטראַכט אַ לייזונג אין דעם אַכטונג פֿאַר די קיט איר ווילן צו קלייַבן.

רעאַקציע באַנד: די 20-50ul סיסטעם איז מער קאַמאַנלי געניצט, און קלענערער וואַליומז זענען מסתּמא צו פאַרשאַפן ערראָרס.אין אַלגעמיין, די ינסטרוקטיאָנס פון די קיט וועט רעקאָמענדירן די נוצן פון PCR אָפּרוף וואַליומז.דו זאלסט נישט זיין קלוג און נוצן קלענערער וואַליומז צו שפּאָרן קאָס.דער ציל פון.דער באַנד רעקאַמענדיד דורך די סוחרים איז פאקטיש טעסטעד, און עס קען זיין אַז זיי קענען נישט סאָלווע די פּראָבלעם פון ערראָרס געפֿירט דורך קליין וואַליומז.
2. דער פאַבריקאַנט און אַרטיקל נומער פון די רער טעלער
אַלעמען ווייסט דעם פּרינציפּ פון פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר.פלואָרעססענסע זאַמלונג איז דער הויפּט דורכגעקאָכט דורך פּקר רער קאַפּס.ווען טשוזינג פּקר קאָנסומאַבלעס, באַצאָלן ופמערקזאַמקייַט צו צוויי פונקטן: גוט ליכט טראַנסמיסיע און פּאַסיק פֿאַר די קיילע.אין אַלגעמיין, די באָרדז און טובז פון מיינסטרים בראַנדז זענען גוט, אָבער איר מוזן קלייַבן קערפאַלי אין טערמינען פון אַדאַפּטיישאַן, אַנדערש איר וועט נישט קענען צו נוצן די קיילע.

4. שפּיץ מדרגה וויסן

MIQE (8) - קפּקר וואַלאַדיישאַן
דאָס איז די שפּיץ בילכערקייַט פון qPCR!אַזוי פילע העלדן זענען געפאלן אין די זאַמד דאָ.פון קורס, עס איז אויך מעגלעך אַז איר זענט מאַזלדיק און די גענעס וואָס איר געלערנט זענען פּשוט, אַזוי איר פלאָוטיד דורך די אייז הייל צוזאמען דעם ווינט.די וועראַפאַקיישאַן אינפֿאָרמאַציע פון ​​qPCR איז בדעה צו פּרובירן די רילייאַבילאַטי פון די דאַטן.מיר רשימה די נייטיק וועראַפאַקיישאַן אינפֿאָרמאַציע ווי גייט:

1. ספּעסיפיקאַטי פּרובירן
די ספּעציפֿישקייט פון ציל דזשין אַמפּלאַפאַקיישאַן איז טעסטעד דורך קאָנטראָלירן צי די עלעקטראָפאָרעסיס בילד איז אַ איין באַנד;סיקוואַנסינג וועראַפאַקיישאַן;מעלטינג ויסבייג צו זען אויב די שפּיץ מאַפּע איז איין;ענזיים דיידזשעסטשאַן וועראַפאַקיישאַן און אנדערע מעטהאָדס.
דאָ, מיר פאָקוס אויף הדי אַנאַליסיס פון ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן מיט דעם מעטאָד פון מעלטינג קורוועס.אין אַלגעמיין, ווען מיר פּלאַן פּרימערז, די גרייס פון דעם פּראָדוקט פראַגמענט איז פארלאנגט צו זיין אין די קייט פון 80-200 בפּ, וואָס מאכט די מעלטינג טעמפּעראַטור פון די פּקר פּראָדוקט 80-85 °C קייט.דעריבער, אויב עס זענען פאַרשידן פּיקס, עס מוזן זיין אנדערע ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן;אויב דער שפּיץ איז אונטער 80 ° C, עס איז בכלל באטראכט צו זיין אַ אָנפאַנגער דימער;אויב דער שפּיץ איז העכער 85 ° C, עס איז בכלל באטראכט צו זיין דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן אָדער מער ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן פון גרויס פראַגמאַנץ.
באַמערקונג: מאל עס איז בלויז אַ איין שפּיץ בייַ 80 ° C.אין דעם צייַט, דעם באַגריף מוזן זיין אַדכירד צו.עס איז מסתּמא אַז די אַמפּלאַפאַקיישאַן רעזולטאַטן זענען אַלע אָנפאַנגער דימערז.

נאָרמאַל מעלטינג ויסבייג (איין שפּיץ מיט קיין ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן)

פּראָבלעמאַטיק מעלטינג ויסבייג (ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן פון ספּוריאָוס פּיקס)
【פאַל אַנאַליסיס】

עס איז אַ הויפּט שפּיץ, אָבער די אָנפאַנגער דימער איז ערנסט
די איין-שפּיץ מעלטינג ויסבייג אין די פיגור אונטן קענען לייכט נאַרן דיין אויגן, טראכטן עס איז אַ גאנץ עקספּערימענט, אָבער דער רעזולטאַט איז גאָר פאַלש.אין דעם צייַט, מיר האָבן צו קוקן אין די מעלטינג טעמפּעראַטור.די שפּיץ טעמפּעראַטור איז אונטער 80 ° C, וואָס איז גאָר אָנפאַנגער-דימער.

קיין ציל פראַגמענט, אַלע אָנפאַנגער דימערז
אט קאן מײן ברודער נישט אפהאלטן.די בילד אונטן איז אַ פאָטאָ גענומען מיט אַ רירעוודיק טעלעפאָן געשיקט צו מיר דורך אַ סקומבאַג.די רייידזשאַנץ ער געוויינט זענען אַלע קאַמאַנלי געוויינט בראַנדז אין די אינדוסטריע.ער האט געביטן פון איין T-פּרעפיקס סאָרט צו אן אנדער T-פּרעפיקס סאָרט.איך מיין אז דו האסט עס שוין געטראכט.דער סקומבאַג האָט צו מיר געשריגן: "דער רעאַגענט וואָס איז געניצט אין דער ערשטער בילד איז צו גוט, און דער שפּיץ איז איין.שפּעטער, נאָך ניצן די רעאַגענט איר רעקאַמענדיד, עס ווערט ווי די רגע בילד, מיט געמישט פּיקס.דו האסט מיר אומגליק געמאכט."
באַזונדער די צוויי גראַפס.אין ערשטער בליק, איינער האט אַ איין שפּיץ, און די אנדערע האט אַ טאָפּל שפּיץ.ומזין, אַ איין שפּיץ איז דאָך פייַן.איז דאָס אמת?
ערגער ווי דו E, אויב איך שטעלן די צוויי בילדער אין די בילד אונטן, איר וועט פֿאַרשטיין מיד.אין פאַקט, מיר זענען לייכט געליימט דורך דעם מין פון בילד.נאָך אָפּגעהיט אַנאַליסיס, מיר געפונען אַז: דער שפּיץ פון דער ערשטער פיגור איז בייַ 75 ° C, וואָס איז גאָר אָנפאַנגער דימער;דער שפּיץ פון די רגע פיגור אויס ביי 75 ° C און 82 ° C, אין מינדסטער עס זענען די פּראָדוקט אויס.

בילדער פון באַמערקונגען פון סטודענטן
אַזוי די פונדאַמענטאַל פּראָבלעם איז נישט די פּראָבלעם פון רייידזשאַנץ, אָבער די פּראָבלעם פון אָנפאַנגער פּלאַן.אין דער זעלביקער צייט, עס אויך באַווייַזן אַז עטלעכע גרויס בראַנדז זענען נישט פון אייַזן קוואַליטעט, און עס אויך באַווייַזן וואָס מיין ברודער האט געזאגט פריער: עס איז נישט די רייידזשאַנט סאָרט וואָס שטיצט דיין אַרטיקל.עס איז דיין אַרטיקל וואָס פּראַפּאָוזד די סאָרט פון רייידזשאַנץ.שטעל זיך דיר נאר פאר, אויב דער סקאם זאל נישט טוישן די רעאגענטן, וואלט מען געשיקט די אומרעכט דאטא צום זשורנאל, און וואס וועט פאסירן וואלט געווען א טראגעדיע.
2. קט ווערט פון פּוסט קאָנטראָל
צי ניט דערקלערן, אויב די ליידיק קאָנטראָל האט אַ Ct ווערט, איז עס ניט פאַרפּעסטיקונג?אָבער, איר נאָך דאַרפֿן צו פֿאַרשטיין וואָס ליידיק קאָנטראָל האט אַ Ct ווערט.אויב עס איז NTC, עס מיטל אַז עס איז פרעמד דנאַ אַזאַ ווי רייידזשאַנט קאַנטאַמאַניישאַן.אויב עס איז NRT, עס מיטל אַז די יקסטראַקטיד רנאַ האט דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן.
3. נאָרמאַל ויסבייג
אַרייַנגערעכנט די שיפּוע און כעזשבן פאָרמולע, די PCR עפעקטיווקייַט קענען זיין קאַלקיאַלייטיד דורך די פאָרמולע.א שליימעסדיק עקספּערימענט ריקווייערז די שיפּוע פון ​​די נאָרמאַל ויסבייג צו דערגרייכן 3.32, און R² צו צוגאַנג 0.9999.
4. לינעאַר דינאַמיש קייט
די דינאַמיש קייט פון דער אָפּרוף איז לינעאַר.לויט די מוסטער געניצט צו דזשענערייט די נאָרמאַל ויסבייג, די דינאַמיש קייט זאָל אַרייַננעמען בייַ מינדסטער 5 קאַנסאַנטריישאַן גראַדיענץ, און באַצאָלן ופמערקזאַמקייט צו די ענדערונג פון Ct וואַלועס אין הויך קאַנסאַנטריישאַן און נידעריק קאַנסאַנטריישאַן גראַדיאַנץ.
5. דיטעקשאַן אַקיעראַסי
ענדערונגען אין qPCR רעזולטאַטן, דאָס איז, נעבעך ריפּיטאַביליטי, דאָס איז, נעבעך פּינטלעכקייַט, זענען געפֿירט דורך פילע סיבות, אַרייַנגערעכנט טעמפּעראַטור, קאַנסאַנטריישאַן און אָפּעראַציע.qPCR פּינטלעכקייַט בכלל ווערט ווייניקער קאַנטראָולאַבאַל ווי קאָפּיע נומער דיקריסאַז.ידעאַללי אין-עקספּערימענטאַל ווערייישאַן, די טעכניש ווערייישאַן זאָל זיין אונטערשיידן פון בייאַלאַדזשיקאַל ווערייישאַן, און בייאַלאַדזשיקאַל רעפּלאַקייטן קענען גלייַך אַדרעס סטאַטיסטיש דיפעראַנסיז אין qPCR רעזולטאַטן צווישן גרופּעס אָדער טריטמאַנץ.אין באַזונדער פֿאַר דיאַגנאָסטיק אַססעס, די בעסטער ינטער-אַסיי פּינטלעכקייַט (ריפּעאַטאַביליטי) צווישן זייטלעך און אָפּערייטערז מוזן זיין געמאלדן.
6. דעטעקשאַן עפעקטיווקייַט און לאָד (אין מולטיפּלעקס קפּקר)
לאָד איז די לאָואַסט קאַנסאַנטריישאַן פון 95% פון positive סאַמפּאַלז דיטעקטאַד.אין אנדערע ווערטער, די קאַנסאַנטריישאַן פון לאָד קאַנטיינד אין אַ סכום פון ציל דזשין רעפּלאַקאַז זאָל נישט יקסיד 5% פון די ניט אַנדערש ריאַקשאַנז.ווען טאן מולטיפּלעקס קפּקר אַנאַליסיס, ספּעציעל פֿאַר סיימאַלטייניאַס דיטעקשאַן פון פונט מיוטיישאַנז אָדער פּאָלימאָרפיסם, מולטיפּלעקס קפּקר דאַרף צו צושטעלן זאָגן אַז די אַקיעראַסי פון קייפל ציל פראַגמאַנץ איז נישט קאַמפּראַמייזד אין דער זעלביקער רער, קייפל דיטעקשאַן און איין רער דיטעקשאַן עפיקאַסי און לאָד זאָל זיין די זעלבע.ספּעציעל ווען הויך-קאַנסאַנטריישאַן ציל גענעס און נידעריק-קאַנסאַנטריישאַן ציל גענעס זענען סיימאַלטייניאַסלי אַמפּלאַפייד, דעם פּראָבלעם מוזן זיין ופמערקזאַמקייט צו.
פּראָבלעמס און סאַלושאַנזאין אַלגעמיין, די פּראָבלעמס אָפט געפּלאָנטערט אין qPCR דיבאַגינג פאָקוס אויף די פאלגענדע אַספּעקץ:
· ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן
· שווער ברירה פון אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן און קאָנפליקט מיט אָנפאַנגער-דימערז
· די אַנילינג טעמפּעראַטור איז ומפּינקטלעך
· צווייטיק סטרוקטור אַפעקץ אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט
ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן
ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַןאַקערז, עס איז בכלל קאַנסידערד צי די אָנפאַנגער פּלאַן איז נישט פּאַסיק, אָבער אויב איר זענט נישט אין אַ ייַלן צו טוישן די אָנפאַנגער, איר קענען פּרובירן די פאלגענדע מעטהאָדס ערשטער (דער פּרינציפּ איז אויך אַטאַטשט):
· פאַרגרעסערן די אַנילינג טעמפּעראַטור - פּרובירן צו מאַכן שוואַך הידראָגען קייטן ניט ביכולת צו טייַנען;
· פאַרקירצן אַנילינג און ילאָנגגיישאַן צייַט - רעדוצירן די געלעגנהייַט פון שוואַך הידראָגען קייטן;
· רעדוצירן אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן - רעדוצירן די געלעגנהייַט פון ביינדינג פון יבעריק פּרימערז און ניט-ציל מקומות;
נידעריק אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט
דער פאַרקערט סיטואַציע צו ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן - נידעריק אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט, און די מיטלען צו האַנדלען מיט נידעריק אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט זענען פּונקט דער פאַרקערט:
· פאַרלענגערן די אַנילינג און ילאָנגגיישאַן צייַט;
· טוישן צו דריי-שריט פּקר און רעדוצירן די אַנילינג טעמפּעראַטור;
· פאַרגרעסערן די קאַנסאַנטריישאַן פון אָנפאַנגער;
Ps: פילע גראַדזשאַוואַט סטודענטן געבוירן אין די 90 ס זענען נישט גרייט צו לערנען ווי צו דיבאַג יקספּעראַמאַנץ, און האָפֿן אַז די קיט קענען גאָר סאָלווע די פּראָבלעם (אויב איר ווילן צו גיין צו אַ רייידזשאַנט פירמע צו טאָן פאָרשונג און אַנטוויקלונג נאָך גראַדזשאַוויישאַן), אין פאַקט, די רייידזשאַנט מאַניאַפאַקטשערערז אויך טראַכטן אַזוי, איך האָפֿן עס איז אַ נאַר. אַבזאָרפּשאַן סיבות.כּדי צו לייכט סאָלווע דעם פּראָבלעם, פאָאָלס נאָך האָבן צו לייענען די הקדמה פון די רייידזשאַנט פירמע צו זען אויב עס איז אַ פאַקטאָר וואָס אַבזאָרבז שוואַך הידראָגען קייטן.
שווער ברירה פון אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן און קאָנפליקט מיט אָנפאַנגער-דימערז
מעטאָד 1: אין אַלגעמיין, די קיט ינסטראַקשאַנז פֿאַר qPCR האָבן רעקאַמענדיד סיסטעמען און רעקאַמענדיד אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַנז.
מעטאָד 2: דיבאַגינג דורך באַשטעטיקן די אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן גראַדיענט.די בילד אונטן איז סטאָלען פון אַ פירמע צו אילוסטרירן.די פיגור אונטן ווייזט די פלואָרעססענסע קוואַנטיטאַטיווע רעזולטאַטן געמאכט מיט דריי אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן גראַדיענץ (100nM, 250nM, 500nM) און פיר מוסטער קאַנסאַנטריישאַן גראַדיענץ (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).די Ct ווערט פון די יקספּערמענאַל רעזולטאַטן איז פּלאַטיד ווי גייט:

אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן סעלעקציע קאַנקאַטאַנייט יעדער אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן אין אַ שורה ווי גייט:

די ברירה פון אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן איז קלאָר ווי דער טאָג, די לינעאַר שייכות פון די אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן פון 100nM און 250nM איז בעסער, און די לינעאַר שייכות פון די אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן פון 500nM איז לעפיערעך נעבעך.אין 100nM און 250nM, די Ct ווערט פון 250nM איז לעפיערעך קליין, אַזוי די אָפּטימאַל אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן איז 250nM.אין אַלגעמיין, שטרענג אָנפאַנגער-דימערז קענען זיין געזען אין די מעלטינג ויסבייג.וואָס אויב די דיזיינד פּרימערז קענען נישט ויסמיידן אָנפאַנגער-דימערז?
מעטאָד 3: רעדוצירן די סומע פון ​​אָנפאַנגער און פאַרגרעסערן די אַנילינג טעמפּעראַטור (ניט דאַרפֿן צו דערקלערן).
די עמפּיריקאַל ווערט פון די אַנילינג טעמפּעראַטור איז 60 ℃.אויב איר זענט נישט זיכער, ווי צו אויסקלייַבן אַ מער פּאַסיק אַנילינג טעמפּעראַטור?דער ענטפער איז די זעלבע ווי די ברירה פון אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן -גראַדיענט פּרובירן.נעמען אַ בילד פון Bio-rad פירמע צו אילוסטרירן דעם פּראָבלעם.פֿאַר די אַמפּלאַפאַקיישאַן פון אַ זיכער ציל פראַגמענט, שטעלן אַכט טעמפּעראַטור גראַדיענץ, יעדער מיט דריי רעפּאַטישאַנז, און די באקומען אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג איז ווי גייט:

אַנילינג טעמפּעראַטור סעלעקציע:
· 70 ° C, 69 ° C - בייסיקלי, די אָנפאַנגערס קענען ניט זיין קאַמביינד, אַזוי עס איז קיין אַמפּלאַפאַקיישאַן.
· 67.3 ° C - עס איז אַ קליין סומע פון ​​​​אַמפּלאַפאַקיישאַן אין די אָנהייב, און די Ct ווערט איז לעפיערעך גרויס.
·64.5°C——די Ct ווערט דיקריסאַז.
· ביי 60.7 ° C, 58.0 ° C, 56.2 ° C, און 55.0 ° C, די Ct וואַלועס בייסיקלי טענדיד צו זיין סטאַביל, אָבער די לעצט פלורעסאַנס וואַלועס זענען אַנדערש.
ווי צו קלייַבן?פּרינציפּ: דער ערשטער פּרינציפּ איז די העכער Ct ווערט.פֿאַר דער זעלביקער Ct ווערט, קלייַבן אַ העכער אַנילינג טעמפּעראַטור צו ויסמיידן דימעריזיישאַן און ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.כאָטש עס איז אַ העכער פלואָרעססענסע ווערט ביי 55 ° C, עס קען זיין דימערז אָדער ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן אין עס.
אָבער אויב איר זענט אַזוי קלוג ווי איר, איר וועט באשטימט טראַכטן: לאַדזשיקלי גערעדט, אויב די PCR אָפּרוף איז זייער ספּעציפיש, ווי לאַנג ווי די אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן יקסידז די מינימום פאָדערונג, די הויך און נידעריק פונקטן זאָל האָבן קיין ווירקונג, פּונקט ווי פלורעסאַנט דיעס און דנטפּס.טאַקע, ווי לאַנג ווי די אַנילינג טעמפּעראַטור איז אָפּטימיזעד רעכט, די ווירקונג פון אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן אויף Ct ווערט וועט געוויינטלעך זיין מינאַמייזד.

די אַנילינג טעמפּעראַטור איז אָפּטימיזעד רעכט, און די ווירקונג פון אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן אויף קאָרט וועט זיין מינאַמייזד
צווייטיק סטרוקטור אַפעקץ אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט
לאָמיר נעמען די בילד פֿון Bio-rad צו אילוסטרירן דעם פּראָבלעם.עס אויך דיזיינז אַ טעמפּעראַטור גראַדיענט צו פאַרגרעסערן אַ דזשין מיט אַ צווייטיק סטרוקטור.

צווייטיק סטרוקטור ימערדזשיז
עס קען זיין געזען אַז ווען די טעמפּעראַטור גראַדיענט דיקריסאַז, פּראָדוקטן אָנהייבן צו דערשייַנען און די Ct ווערט באוועגט פאָרויס, ריטשינג די מינימום ווערט ביי 60.7 ° C, און דערנאָך ווי די טעמפּעראַטור גראַדיענט דיקריסאַז, די Ct ווערט ווערט גרעסער.קאָנווערסעלי, ווי די טעמפּעראַטור ינקריסיז, די צווייטיק סטרוקטור אָפּענס און די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט ינקריסיז.נאָך דערגרייכן אַ זיכער טעמפּעראַטור, ינקריסינג די טעמפּעראַטור קענען נישט פֿאַרבעסערן די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט.ווייַל די אָנפאַנגערס קענען ניט זיין סטאַביל קאַמביינד אין דעם צייַט.דעריבער,קוק פֿאַר די טעמפּעראַטור מיט די לאָואַסט Ct ווערט, וואָס איז דער בעסטער טעמפּעראַטור פֿאַר אַמפּלאַפייינג די צווייטיק סטרוקטור מוסטער!פון קורס, קלוג פאָאָלס מוזן וויסן אַז אויב עס איז ניט נייטיק, עס איז בעסטער צו טוישן די אָנפאַנגער און ויסמיידן די צווייטיק סטרוקטור געגנט.
5. אַפּפּליקאַטיאָן מדרגה
MIQE — דאַטאַ אַנאַליסיס

די דאַטן אַנאַליסיס איז דער הויפּט געגעבן דורך די פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר קיילע.אין דעם פריערדיקן אַרטיקל, אַ פּלאַץ פון דאַטן אַנאַליסיס אַרבעט איז דורכגעקאָכט, אַזאַ ווי די ליידיק קאָנטראָל, וואָס איז דערקלערט אין די פּלאַן פון דער עקספּערימענט.די ינערלעך רעפֿערענץ גענעס, איבערחזרן נומערן, אאז"ו ו האָבן שוין קלעראַפייד., דאָ מיר דער הויפּט דערקלערן די אַפּלאַקיישאַן פון qPCR.
qPCR איז וויידלי געניצט, און יקספּערמענאַל וועראַפאַקיישאַן און דיאַגנאָסיס פון נוקלעיק זויער זענען די מערסט קאַמאַנלי געניצט סינעריאָוז.
אַבסאָלוט קוואַנטיפיקאַטיאָן
קלאָץ (ערשט קאַנסאַנטריישאַן) האט אַ לינעאַר שייכות מיט די נומער פון סייקאַלז.א נאָרמאַל ויסבייג קענען זיין ציען פון אַ נאָרמאַל מיט אַ באַוווסט ערשט קאָפּיע נומער, דאָס הייסט, די לינעאַר שייכות פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן אָפּרוף קענען זיין באקומען.לויט די Ct ווערט פון די מוסטער, די קאַנסאַנטריישאַן אין די מוסטער קענען זיין קאַלקיאַלייטיד.די נומער פון טעמפּלאַטעס צו אַרייַננעמען.

אַבסאָלוט קוואַנטיטאַטיווע קאַלקולאַטיאָן מעטאַד
אַבסאָלוט קוואַנטיפיקאַטיאָן מוזן זיין באזירט אויף די נאָרמאַל ויסבייג.צו מאַכן אַ נאָרמאַל ויסבייג, אַ נאָרמאַל איז פארלאנגט.יוזשאַוואַלי, דער נאָרמאַל איז אַ פּלאַזמיד באקומען דורך קלאָונינג די ציל דזשין.פארוואס איז עס אַ פּלאַזמיד?ווייַל די קייַלעכיק פּלאַזמיד דנאַ איז די מערסט סטאַביל.צעפירן די נאָרמאַל פּראָדוקט אין 5-6 גראַדיענץ לויט די דאַבלינג פאַרהעלטעניש (10-פאַרלייגן דיילושאַן), און באַצאָלן ופמערקזאַמקייַט צו די יונאַפאָרמאַטי ווען דילוטינג.לאָזן די Ct ווערט פאַלן צווישן 15-30.

נאָרמאַל צוגרייטונג
אין דער זעלביקער צייט, די מוסטער צו זיין טעסטעד זאָל אויך דיילוטאַד אַקאָרדינגלי (געדענקען די דיילושאַן פאַקטאָר), און די Ct ווערט זאָל אויך פאַלן צווישן 15-30.דער נאָרמאַל פּראָדוקט + די מוסטער צו זיין טעסטעד זענען שטעלן אויף די מאַשין צוזאַמען.נאָך די לויפן, אַ נאָרמאַל ויסבייג איז געמאכט מיט די נאָרמאַל מאַטעריע, און די סאַמפּאַלז צו זיין טעסטעד זענען געבראכט אין די נאָרמאַל ויסבייג צו רעכענען די קאַנסאַנטריישאַן.
העפּאַטיטיס ב ווירוס הבוו קוואַנטאַפאַקיישאַן איז אַ טיפּיש אַבסאָלוט קוואַנטאַפאַקיישאַן, וואָס קענען רעכענען די ווירוס קאָפּיע נומער אין 1 מל פון בלוט.
כעזשבן פון קאָפּיע נומער
מוסטער קאַנסאַנטריישאַן צו זיין טעסטעד (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × דיילושאַן פאַקטאָר
מוסטער מאָלעקולאַר וואָג = נומער פון באַסעס × 324
די קאָפּיע נומער פון די מוסטער צו זיין טעסטעד (עקזעמפלארן / אַל) = די קאַנסאַנטריישאַן פון די מוסטער צו זיין טעסטעד / די מאָלעקולאַר וואָג פון די מוסטער × 6 × 1014

כעזשבן אופֿן פון קאָפּיע נומער

די אויבן איז די כעזשבן אופֿן פֿאַר דיטערמאַנינג די קוואַנטיטי.דאס איז א מאטעמאטישער פראבלעם וואס מען קען לייזן נאכן פארענדיקן די יינגער מיטלשול, און מאטעמאטישע פראבלעם ווערן בכלל געלייזט דורך קאמפיוטערס.אויב איר טאָן ניט פֿאַרשטיין, איר קענען קומען צו יבערגעבן.
קאָרעוו קוואַנטאַפאַקיישאַן
קאָרעוו קוואַנטיפיקאַטיאָן איז דער הויפּט געניצט אין וויסנשאפטלעכע פאָרשונג.ווי פילע ווירוסעס זענען אין 1 מל פון בלוט, און עס איז אַ דנאַ ווירוס, דאָס איז אַ לעפיערעך דיטערמאַניסטיק געשעעניש: די סומע פון ​​​​בלוט קענען זיין באשלאסן, און די דנאַ ווירוס איז לעפיערעך סטאַביל.אָבער, עס איז שווער פֿאַר אונדז צו פאַרגלייַכן די נומער פון טראַנסקריפּציע קאָפּיעס פון אַ זיכער דזשין אין אַ בלאַט, ווייַל עס איז שווער צו באַשטימען די גרייס, וואָג און צערטלעכקייַט פון דעם בלאַט, די סומע פון ​​יקסטראַקטיד רנאַ איז שווער צו באַשטימען, און די עפעקטיווקייַט פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע איז אויך שווער צו באַשטימען, דאָס הייסט, יעדער שריט קען מאַכן די יקספּערמענאַל דאַטן האָבן באַגז און קענען ניט זיין געוויינט.
דעריבער, קאָרעוו קוואַנטאַפאַקיישאַן מוזן פאָרשטעלן אַן עלעמענט:די ינערלעך רעפֿערענץ דזשין.
אין אנדערע ווערטער, קאָרעוו קוואַנטאַפאַקיישאַן איז פאקטיש אַ פאַרגלייַך צווישן די ציל דזשין און די ינערלעך רעפֿערענץ דזשין.קאַמפּערד אין דער זעלביקער געוועב און דער זעלביקער צעל, די השפּעה פון מוסטער גרייס, רנאַ יקסטראַקשאַן סומע, פאַרקערט טראַנסקריפּציע עפעקטיווקייַט און פּקר עפעקטיווקייַט איז לעפיערעך קליין.ווייַל פון די קליין מוסטער גרייס, ביידע ינערלעך רעפֿערענץ גענעס און ציל גענעס זענען לעפיערעך רידוסט.דאָס איז וואָס מיר האָבן שוין אונטערגעשטראכן יונאַפאָרמאַטי און פעסטקייַט פריער.
ינערלעך רעפֿערענץ גענעס זענען בכללכאַוסקיפּינג גענעס(הויז בעכעסקעם גענעס), וואָס אָפּשיקן צו אַ קלאַס פון גענעס וואָס זענען סטאַביל אויסגעדריקט אין אַלע סעלז, און זייער פּראָדוקטן זענען נייטיק צו האַלטן די יקערדיק לעבן אַקטיוויטעטן פון סעלז.
צי ניט צעמישן דעם באַגריף.כאַוסקיפּינג גענעס זענען בייאַלאַדזשיקאַל פונקציע טערמינען, בשעת ינערלעך רעפֿערענץ גענעס זענען יקספּערמענאַל טעכניש טערמינען.כאַוסקיפּינג גענעס דאַרפֿן צו דורכגיין וואַלאַדיישאַן איידער זיי קענען זיין אויסגעקליבן ווי ינערלעך רעפֿערענץ גענעס.
צום ביישפּיל, מיר האָבן אויסגעקליבן עטלעכע כאַוסקיפּינג גענעס אין די פיגור אונטן צו פּרובירן זייער אויסדרוק לעוועלס אין פאַרשידענע געוועב סעלז, און געפֿונען אַז די אויסדרוק לעוועלס פון β-2-מיקראָגלאָבולין זענען גאַנץ אַנדערש פון די פון די אנדערע דריי גענעס, אַזוי זיי קען נישט זיין געוויינט ווי ינערלעך רעפֿערענץ גענעס.

נאָך פארשטאנד די קערעקשאַן פֿונקציע פון ​​די ינערלעך רעפֿערענץ דזשין, צוויי אַלגערידאַמז זענען דערייווד רעכט צו דער הקדמה פון די ינערלעך רעפֿערענץ דזשין.
· טאָפּל נאָרמאַל ויסבייג אופֿן
·2 - △△קט מעטאָד (קאָרט ווערט פאַרגלייַך אופֿן)
אויב איר זענט אינטערעסירט אין לערנען מינים און דזשין פאַנגקשאַנז, ביטע געבן אַרויף די פאָרשונג אויף אַלגערידאַמז און נוצן פאָרמולאַס גלייַך, אָדער נוצן מאַשינז גלייַך;אויב איר זענט אַ גלייך באָכער אין מאטעמאטיק און ינזשעניעריע, ביטע פילן פריי.
טאָפּל נאָרמאַל ויסבייג אופֿן
קוואַנטיפיצירן די ציל דזשין און כאַוסקיפּינג דזשין פון די קאָנטראָל מוסטער און די מוסטער צו זיין טעסטעד דורך די נאָרמאַל ויסבייג, און רעכענען די קאָרעוו ווערט לויט די כעזשבן פאָרמולע, וואָס איז די קאָרעוו אויסדרוק מדרגה.
אַדוואַנטאַגעס: פּשוט אַנאַליסיס, לעפיערעך פּשוט יקספּערמענאַל אַפּטאַמאַזיישאַן
כיסאָרן: פֿאַר יעדער דזשין, יעדער קייַלעכיק פון יקספּעראַמאַנץ מוזן מאַכן אַ נאָרמאַל ויסבייג
אַפּפּליקאַטיאָן: איינער פון די צוויי מערסט קאַמאַנלי געניצט און דערקענט קאָרעוו קוואַנטיטאַטיווע מעטהאָדס אין די לערנען פון דזשין אויסדרוק רעגולירן
די פאָרמולע איז ווי גייט:

ביישפילן זענען ווי גייט:

רעכענען די קאָרעוו סומע באזירט אויף די קוואַנטיטאַטיווע רעזולטאַט
2 - △△Ct מעטאָד (CT ווערט פאַרגלייַך אופֿן)

אַדוואַנטאַגעס: ניט דאַרפֿן צו מאַכן אַ נאָרמאַל ויסבייג
דיסאַדוואַנטידזשיז: עס איז אנגענומען אַז די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט איז נאָענט צו 100%;דער נאָרמאַל דיווייישאַן איז <5%, און די נאָרמאַל ויסבייג און די עפעקטיווקייַט צווישן יעדער אַמפּלאַפאַקיישאַן זענען קאָנסיסטענט;די אַפּטאַמאַזיישאַן פון יקספּערמענאַל טנאָים איז מער קאָמפּליצירט.
אַפּפּליקאַטיאָן: איינער פון די צוויי מערסט קאַמאַנלי געניצט און דערקענט קאָרעוו קוואַנטיטאַטיווע מעטהאָדס אין די לערנען פון דזשין אויסדרוק רעגולירן

פון קורס, די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט איז יוזשאַוואַלי אוממעגלעך צו זיין בישליימעס 1. קערעקשאַן אופֿן: אויב מיר וויסן אַז די ציל דזשין און די רעפֿערענץ דזשין האָבן די זעלבע אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט, אָבער די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט איז נישט גלייך צו 1, דעמאָלט 2-△△Ct קענען זיין קערעקטאַד ווי: (1+E )－△△Ct, אויב די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט איז 0, פֿאַר בייַשפּיל, אויב די 0 אַמפּליפיקאַטיאָן עפעקטיווקייַט איז 1, פֿאַר בייַשפּיל, 1 איז קערעקטאַד. .95–△△קט
ביז איצט, דער אינהאַלט וועגן פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר איז געקומען צו אַ סוף.