דער זייַל האָט זיך אָנגעשטויסן

נאָך די זייַל פּלאַגד, די רנאַ טראָגן איז רידוסט אָדער אפילו אוממעגלעך צו רייניקן די רנאַ, און די באקומען רנאַ מאַסע איז נידעריק.

פּראָסט גרונט אַנאַליסיס:

1. מוסטער ברייקס זענען נישט גרונטיק.

מוסטער ברייקידזש טוט נישט גאָר פאַרשאַפן דנאַ-רייניקונג זייַל צו זיין אפגעשטעלט, בשעת אַפעקטינג רנאַ טראָגן און קוואַליטעט.מיר רעקאָמענדירן גיך גרינדינג אָפּעראַציע אין אַ גענוג פליסיק ניטראָגען ווען איר צעבראכן די סאַמפּאַלז, פּרוּווט צו צעטרעטן די מוסטער צעל וואַנט, צעל מעמבראַנע און אנדערע געוועב.פֿאַר פאַבריק סאַמפּאַלז פון פּאָליאָל פּאַליסאַקעריידז, מיר רעקאָמענדירן צו נוצן פּלאַנט גאַנץ רנאַ ISOLATION KIT PLUS.

2. ווען סאַקשאַן די אפגעשיידט מוסטער סופּערנאַטאַנט מיט דנאַ-רייניקונג זייַל, די מעגלעך צעל פראַגמאַנטיד אָפּזאַץ קען זיין ינכיילד.

די צעל פראַגמאַנטיד סעדימענץ גענומען וועט פאַרשאַפן די RNA-בלויז זייַל וואָס וועט זיין אפגעשטעלט ווען די רנאַ אַדסאָרפּטיאָן אָפּעראַציע איז דורכגעקאָכט (זען שריט 6).מיר רעקאָמענדירן איר קערפאַלי ווען סאַקשאַן דעם סופּערנאַטאַנט צו ויסמיידן צעל דעבריס סאַקט.

3. מוסטער ערשט סומע איז אויך פיל.

יבעריק מוסטער באַניץ וועט רעזולטאַט אין דערענדיקט מוסטער פראַגמאַנטיישאַן אָדער דערענדיקט צעל ליסיס דורך Buffer PSL1, ריזאַלטינג אין בלאַקידזש פון די רייניקונג זייַל בעשאַס רייניקונג.פּלאַנט גאַנץ רנאַ יסאָלאַטיאָן קיט יעדער איין פּיוראַפייד אַפּערייטינג מוסטער איז 50 מג.פֿאַר פאַבריק סאַמפּאַלז פון פּאָליאָל פּאַליסאַקעריידז, מיר רעקאָמענדירן צו פּרובירן פּלאַנט גאַנץ RNA ISOLATION KIT PLUS.

4. די טעמפּעראַטור פון די סענטריפודזש איז צו נידעריק.

די גאנצע רנאַ אפגעזונדערטקייט און רייניקונג פּראָצעס איז דורכגעקאָכט אין צימער טעמפּעראַטור (20-25°C), אַחוץ אַז די מוסטער געוועב איז צעבראכן דורך פליסיק ניטראָגען.די טעמפּעראַטור פון עטלעכע קריאָגעניק סענטריפוגעס איז נידעריקער ווי 20℃, וואָס קען פאַרשאַפן בלאַקידזש פון דנאַ-רייניקונג זייַל און / אָדער רנאַ-בלויז זייַל.אויב דאָס כאַפּאַנז, שטעלן די סענטריפודזש טעמפּעראַטור צו 20-25℃, אוןמאַכן זיכער אַז די ליסיס געמיש און / אָדער די עטאַנאָל-צוגעלייגט סופּערנאַטאַנט איז פּרעהעאַטעד צו 37°C.

קיין רנאַ יקסטראַקטיד אָדער רנאַ טראָגן איז נידעריק

עס זענען יוזשאַוואַלי פילע סיבות וואָס ווירקן די אָפּזוך עפעקטיווקייַט, אַזאַ ווי: מוסטער רנאַ אינהאַלט, אָפּעראַציע אופֿן, די ילושאַן באַנד, עטק.

אַנאַליסיס פון פּראָסט סיבות ווי אונטן:

1. אַן אייז וואַנע אָדער נידעריק טעמפּעראַטור (4 ° C) סענטריפוגיישאַן איז דורכגעקאָכט בעשאַס די אָפּעראַציע.

פאָרשלאָג: אַרבעטן אין צימער טעמפּעראַטור (15-25°C) אין דער גאנצער פּראָצעס, טאָן ניט טאָן ייַז וואַנע און נידעריק טעמפּעראַטור סענטריפוגיישאַן.

2.טהע רנאַ איז דיגריידיד רעכט צו ימפּראַפּער פּרעזערוויישאַן פון די מוסטער אָדער לאַנג-טערמין פּרעזערוויישאַן פון די מוסטער.

רעקאָמענדאַציע: פריש געזאמלט סאַמפּאַלז זאָל זיין געשווינד פאַרפרוירן אין פליסיק ניטראָגען, און דעמאָלט סטאָרד בייַ -80 ° C פֿאַר אַ לאַנג צייַט, ויסמיידן ריפּיטיד ייַז קאַלט און טאָינג פון סאַמפּאַלז;אָדער מיד ווייקן די סאַמפּאַלז אין רנאַ סטייבאַלייזער רנאַלייטער לייזונג (כייַע סאַמפּאַלז).

3.ינסופיקאַנט מוסטער פראַגמאַנטיישאַן און ליסיס פירן צו בלאַקידזש פון די רייניקונג זייַל.

פאָרשלאָג: ווען גרינדינג די געוועב, ביטע ענשור אַז די געוועב איז גענוג ערד, און געשווינד אַריבערפירן עס צו די פאַר-צוגעגרייט Buffer PSL1 (באַשטעטיקן אַז די ריכטיק פּראָפּאָרציע פון ​​β-ME איז צוגעגעבן, זען שריט 1 פון די פּראָצעדור).

4.די עלוענט איז צוגעגעבן פאַלש.

פאָרשלאָג: מאַכן זיכער אַז RNase-Free ddH2O איז דריפּט אין די מיטן פון די רייניקונג זייַל מעמבראַנע.

5.די ריכטיק באַנד פון אַבסאָלוט עטאַנאָל איז נישט צוגעגעבן צו Buffer PSL2 אָדער Buffer PRW2.

פאָרשלאָג: ביטע נאָכפאָלגן די ינסטראַקשאַנז, לייגן די ריכטיק באַנד פון אַבסאָלוט עטאַנאָל צו Buffer PSL2 און Buffer PRW2 און מישן געזונט איידער די קיט איז געניצט.

6. די סומע פון ​​געוועב מוסטער איז ינאַפּראָופּרייט.

פאָרשלאָג: נוצן 50 מג פון געוועב פּער 500 μל Buffer PSL1.ניצן צו פיל געוועב וועט רעדוצירן די סומע פון ​​RNA יקסטראַקטיד און די ריינקייַט פון די ריזאַלטינג רנאַ וועט אויך זיין רידוסט.מיר שטארק רעקאָמענדירן אַז די ערשט מוסטער דאָוסאַדזש זאָל נישט יקסיד 50 מג פּער רנאַ יקסטראַקשאַן אָפּעראַציע.

7.ינאַפּפּראָפּריאַטע ילושאַן באַנד אָדער דערענדיקט ילושאַן.

פאָרשלאָג: די ילואַנט באַנד פון די רייניקונג זייַל איז 50-200 μל;אויב די ילושאַן ווירקונג איז נישט באַפרידיקנדיק, עס איז רעקאַמענדיד צו פאַרברייטערן די צייט אין צימער טעמפּעראַטור נאָך אַדינג פּרעהעאַטעד רנאַסע-פריי דדה2אָ, אַזאַ ווי 5-10 מינוט.

8. די רייניקונג זייַל האט עטאַנאָל רעזאַדו נאָך וואַשינג מיט BufferPRW2.

פאָרשלאָג: אויב די ליידיק רער איז סענטריפודזשד פֿאַר 1 מינוט און עס איז נאָך עטאַנאָל נאָך וואַשינג אין באַפער פּרוו 2, איר קענען פאַרגרעסערן די צייט פון די ליידיק רער סענטריפוגיישאַן צו 2 מינוט, אָדער שטעלן די רייניקונג זייַל אין צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 5 מינוט צו גאָר באַזייַטיקן די ריזידזשואַל עטאַנאָל.

9.די ינווענטאַר איז געניצט פאַלש.

פאָרשלאָג: פֿאַר פאַבריק סאַמפּאַלז פון פּאָליפענאָליק פּאַליסאַקעריידז, ניצן פּראָסט קיץ אַזאַ ווי פּלאַנט גאַנץ רנאַ יסאָלאַטיאָן קיט קען נישט זיין ביכולת צו באַקומען ידעאַל רנאַ סאַמפּאַלז.מיר רעקאָמענדירן איר צו נוצן פּלאַנט גאַנץ רנאַ יסאָלאַטיאָןקיט פּלוס, וואָס איז ספּעשאַלי דיזיינד פֿאַר פּאָליפענאָליק פּאַליסאַקערייד פאַבריק סאַמפּאַלז.א ינווענטאַר ספּעשאַלי דעוועלאָפּעד פֿאַר יקסטראַקטינג רנאַ פון פּאָליפענאָל און פּאַליסאַקערייד פאַבריק סאַמפּאַלז.

OD260/OD280 ווערט איז נידעריק

רנאַ ילושאַן מיט דדH2O און געניצט פֿאַר ספּעקטראָפאָטאָמעטער רידינגז רעזולטאַטן אין נידעריק OD260/OD280 וואַלועס.מיר רעקאָמענדירן ניצן 10 מם טריס-הקל, pH 7.5 (אלא ווי רנאַסע-פריי דדה2אָ צו ילוטע רנאַ) צו קריגן לעפיערעך ריכטיק OD260/OD280 וואַלועס, זען "רנאַ קאַנסאַנטריישאַן און רייניקונג אַסאַסאַז" אויף בלאַט 19.

די פּיוראַפייד רנאַ איז דיגריידיד

די קוואַליטעט פון פּיוראַפייד רנאַ איז שייַכות צו סיבות אַזאַ ווי מוסטער פּרעזערוויישאַן, רנאַסע קאַנטאַמאַניישאַן און מאַניפּיאַליישאַן.

אַנאַליסיס פון פּראָסט סיבות:

1. געוועב סאַמפּאַלז זענען נישט סטאָרד אין צייט נאָך זאַמלונג.

רעקאָמענדאַציע: אויב די געוועב סאַמפּאַלז זענען נישט געניצט אין צייט נאָך זאַמלונג, ביטע קראָם זיי אין פליסיק ניטראָגען בייַ נידעריק טעמפּעראַטור גלייך אָדער אַריבערפירן זיי צו -80 ° C פֿאַר לאַנג-טערמין סטאָרידזש נאָך שנעל ייַז קאַלט אין פליסיק ניטראָגען, אָדער מיד ייַנטונקען די סאַמפּאַלז אין רנאַ סטייבאַלייזער רנאַלייטער לייזונג (כייַע סאַמפּאַלז).פֿאַר רנאַ יקסטראַקשאַן, פּרובירן צו נוצן פריש געזאמלט געוועב סאַמפּאַלז.

2.רעפּעאַטעד ייַז קאַלט און טאָינג פון געוועב סאַמפּאַלז.

פאָרשלאָג: ווען סטאָרינג געוועב סאַמפּאַלז, עס איז בעסטער צו שנייַדן זיי אין קליין ברעקלעך פֿאַר פּרעזערוויישאַן, און נעמען אַ טייל פון זיי ווען איר נוצן זיי צו ויסמיידן די דערנידעריקונג פון רנאַ געפֿירט דורך ריפּיטיד ייַז קאַלט און טאָינג פון די סאַמפּאַלז.

3.RNase איז באַקענענ אין די אָפּעראַציע צימער אָדער ניט וואָרן דיספּאָוזאַבאַל גלאַווז, מאַסקס, אאז"ו ו.

פאָרשלאָג: רנאַ יקסטראַקשאַן יקספּעראַמאַנץ זענען בעסטער דורכגעקאָכט אין באַזונדער רנאַ אַפּעריישאַנז, און די לאַבאָראַטאָריע טיש זאָל זיין קלינד איידער דער עקספּערימענט, און דיספּאָוזאַבאַל גלאַווז און מאַסקס זאָל זיין וואָרן בעשאַס דער עקספּערימענט צו ויסמיידן רנאַ דערנידעריקונג געפֿירט דורך די הקדמה פון רנאַסע צו די גרעסטע מאָס.

4.טהע רייידזשאַנט איז קאַנטאַמאַנייטאַד דורך רנאַסע בעשאַס נוצן.

פאָרשלאָג: פאַרבייַטן מיט אַ נייַע סעריע פון ​​​​פּלאַץ גאַנץ רנאַ יקסטראַקשאַן קיץ פֿאַר פֿאַרבונדענע יקספּעראַמאַנץ.

5. די סענטריפודזש טובז און פּייפּעט עצות געניצט פֿאַר רנאַ מאַניפּיאַליישאַן זענען קאַנטאַמאַנייטאַד מיט רנאַסע.

פאָרשלאָג: מאַכן זיכער אַז די סענטריפודזש טובז, פּייפּעט עצות, פּיפּעטטעס, עטק געניצט אין רנאַ יקסטראַקשאַן זענען אַלע רנאַסע-פֿרייַ.

אינסטרוקציעס מאַנואַל:

פּלאַנט גאַנץ רנאַ יסאָלאַטיאָן קיט פּלוס ינסטרוקטיאָן מאַנואַל