קיין אַמפּלאַפאַקיישאַן סיגנאַלז

1. די טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע אין די קיט פארלירט זייַן טעטיקייט רעכט צו ימפּראַפּער סטאָרידזש אָדער עקספּעריישאַן פון די קיט.
רעקאָמענדאַציע: באַשטעטיקן די סטאָרידזש טנאָים פון די קיט;שייַעך-צולייגן אַ צונעמען סומע פון ​​Taq DNA פּאָלימעראַסע צו די פּקר סיסטעם אָדער קויפן אַ נייַ פאַקטיש צייט פּקר קיט פֿאַר פֿאַרבונדענע יקספּעראַמאַנץ.

2. עס זענען אַ פּלאַץ פון ינכיבאַטערז פון טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע אין די דנאַ מוסטער.
פאָרשלאָג: רעפּוריפי די מוסטער אָדער רעדוצירן די סומע פון ​​​​טעמפּלעד געניצט.

3. די Mg2+ קאַנסאַנטריישאַן איז נישט פּאַסיק.
רעקאָמענדאַציע: די Mg2+ קאַנסאַנטריישאַן פון די 2 × רעאַל פּקר מיקס וואָס מיר צושטעלן איז 3.5 מם.אָבער, פֿאַר עטלעכע ספּעציעל פּרימערז און טעמפּלאַטעס, די Mg2+ קאַנסאַנטריישאַן קען זיין העכער.דעריבער, איר קענען גלייַך לייגן MgCl2 צו אַפּטאַמייז די Mg2+ קאַנסאַנטריישאַן.עס איז רעקאַמענדיד צו פאַרגרעסערן די Mg2+ 0.5מם יעדער מאָל פֿאַר אַפּטאַמאַזיישאַן.

4. די פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן טנאָים זענען נישט פּאַסיק, און די אָנפאַנגער סיקוואַנס אָדער קאַנסאַנטריישאַן איז ימפּראַפּער.
פאָרשלאָג: באַשטעטיקן די קערעקטנאַס פון די אָנפאַנגער סיקוואַנס און די אָנפאַנגער איז נישט דיגריידיד;אויב די אַמפּלאַפאַקיישאַן סיגנאַל איז נישט גוט, פּרובירן צו נידעריקער דער אַנילינג טעמפּעראַטור און סטרויערן די אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן אַפּראָופּרייטלי.

5. די סומע פון ​​מוסטער איז אויך קליין אָדער צו פיל.
רעקאָמענדאַציע: דורכפירן דילושאַן פון טעמפּלאַטע לינעאַריזאַטיאָן גראַדיענט און סעלעקטירן דעם מוסטער קאַנסאַנטריישאַן מיט דער בעסטער פּקר ווירקונג פֿאַר פאַקטיש צייט פּקר עקספּערימענט.

NTC האט צו הויך פלורעסאַנס ווערט

1.רעאַגענט קאַנטאַמאַניישאַן געפֿירט בעשאַס אָפּעראַציע.
רעקאָמענדאַציע: פאַרבייַטן מיט נייַע רייידזשאַנץ פֿאַר פאַקטיש צייט פּקר יקספּעראַמאַנץ.

2. קאַנטאַמאַניישאַן פארגעקומען בעשאַס דער צוגרייטונג פון די פּקר אָפּרוף סיסטעם.
רעקאָמענדאַציע: נעמען נייטיק פּראַטעקטיוו מיטלען בעשאַס אָפּעראַציע, אַזאַ ווי: טראָגן לייטעקס גלאַווז, ניצן אַ פּיפּעטטע שפּיץ מיט אַ פילטער, אאז"ו ו.

3. די פּרימערז זענען דיגריידיד, און די דערנידעריקונג פון די פּרימערז וועט פאַרשאַפן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.
פאָרשלאָג: ניצן SDS-PAGE עלעקטראָפאָרעסיס צו דעטעקט צי די פּרימערז זענען דיגריידיד, און פאַרבייַטן זיי מיט נייַע אָנפאַנגערס פֿאַר פאַקטיש צייט פּקר יקספּעראַמאַנץ.

אָנפאַנגער דימער אָדער ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן

1. די Mg2+ קאַנסאַנטריישאַן איז נישט פּאַסיק.
רעקאָמענדאַציע: די Mg2+ קאַנסאַנטריישאַן פון די 2 × Real PCR EasyTM מיקס וואָס מיר צושטעלן איז 3.5 מם.אָבער, פֿאַר עטלעכע ספּעציעל פּרימערז און טעמפּלאַטעס, די Mg2+ קאַנסאַנטריישאַן קען זיין העכער.דעריבער, איר קענען גלייַך לייגן MgCl2 צו אַפּטאַמייז די Mg2+ קאַנסאַנטריישאַן.עס איז רעקאַמענדיד צו פאַרגרעסערן די Mg2+ 0.5מם יעדער מאָל פֿאַר אַפּטאַמאַזיישאַן.

2. די פּקר אַנילינג טעמפּעראַטור איז אויך נידעריק.
פאָרשלאָג: פאַרגרעסערן די פּקר אַנילינג טעמפּעראַטור מיט 1 ℃ אָדער 2 ℃ יעדער מאָל.

3. די פּקר פּראָדוקט איז אויך לאַנג.
רעקאָמענדאַציע: די לענג פון די פאַקטיש צייט פּקר פּראָדוקט זאָל זיין צווישן 100-150 בפּ, נישט מער ווי 500 בפּ.

4. די פּרימערז זענען דיגריידיד, און די דערנידעריקונג פון די פּרימערז וועט פירן צו דער אויסזען פון ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.
פאָרשלאָג: ניצן SDS-PAGE עלעקטראָפאָרעסיס צו דעטעקט צי די פּרימערז זענען דיגריידיד, און פאַרבייַטן זיי מיט נייַע אָנפאַנגערס פֿאַר פאַקטיש צייט פּקר יקספּעראַמאַנץ.

5. די פּקר סיסטעם איז ימפּראַפּער, אָדער די סיסטעם איז אויך קליין.
פאָרשלאָג: די PCR אָפּרוף סיסטעם איז צו קליין וועט פאַרמינערן די דיטעקשאַן אַקיעראַסי.עס איז בעסטער צו נוצן די רעאַקציע סיסטעם רעקאַמענדיד דורך די קוואַנטיטאַטיווע פּקר קיילע צו לויפן די פאַקטיש צייט פּקר עקספּערימענט.

נעבעך ריפּיטאַביליטי פון קוואַנטיטאַטיווע וואַלועס

1. די קיילע איז מאַלפאַנגקשאַנינג.
פאָרשלאָג: עס קען זיין ערראָרס צווישן יעדער פּקר לאָך פון די קיילע, ריזאַלטינג אין אַ שלעכט רעפּראָדוסיביליטי בעשאַס טעמפּעראַטור פאַרוואַלטונג אָדער דיטעקשאַן.ביטע טשעק לויט די ינסטראַקשאַנז פון די קאָראַספּאַנדינג קיילע.

2.דער מוסטער ריינקייַט איז נישט גוט.
רעקאָמענדאַציע: ימפּורע סאַמפּאַלז וועט פירן צו אַ נעבעך רעפּראָדוסיביליטי פון דער עקספּערימענט, וואָס כולל די ריינקייַט פון די מוסטער און אָנפאַנגער.עס איז בעסטער צו רייניקן דעם מוסטער, און די אָנפאַנגערס זענען בעסטער פּיוראַפייד דורך SDS-PAGE.

3. די פּקר סיסטעם צוגרייטונג און סטאָרידזש צייט איז אויך לאַנג.
פאָרשלאָג: ניצן די פאַקטיש צייט פּקר סיסטעם פֿאַר פּקר עקספּערימענט גלייך נאָך צוגרייטונג, און טאָן ניט לאָזן עס באַזונדער פֿאַר צו לאַנג.

4. די פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן טנאָים זענען נישט פּאַסיק, און די אָנפאַנגער סיקוואַנס אָדער קאַנסאַנטריישאַן איז ימפּראַפּער.
פאָרשלאָג: באַשטעטיקן די קערעקטנאַס פון די אָנפאַנגער סיקוואַנס און די אָנפאַנגער איז נישט דיגריידיד;אויב די אַמפּלאַפאַקיישאַן סיגנאַל איז נישט גוט, פּרובירן צו נידעריקער דער אַנילינג טעמפּעראַטור און סטרויערן די אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן אַפּראָופּרייטלי.

5. די פּקר סיסטעם איז ימפּראַפּער, אָדער די סיסטעם איז אויך קליין.
פאָרשלאָג: די PCR אָפּרוף סיסטעם איז צו קליין וועט פאַרמינערן די דיטעקשאַן אַקיעראַסי.עס איז בעסטער צו נוצן די רעאַקציע סיסטעם רעקאַמענדיד דורך די קוואַנטיטאַטיווע פּקר קיילע צו לויפן די פאַקטיש צייט פּקר עקספּערימענט.