עס איז באַוווסט אַז אין די הויפט דאָגמאַ, רנאַ איז די טראַנסקריפּטיאָנאַל מעדיאַטאָר צווישן דנאַ און פּראָטעין אויסדרוק.קאַמפּערד מיט די דיטעקשאַן פון דנאַ, די דיטעקשאַן פון רנאַ קענען מער אַבדזשעקטיוולי פאַרטראַכטנ זיך די דזשין אויסדרוק אין אָרגאַניזאַמז.יקספּעראַמאַנץ מיט רנאַ אַרייַננעמען: qRT-PCR, RNA-Seq, און פוסיאָן דזשין דיטעקשאַן, אאז"ו ו. באַזירט אויף די קעראַקטעריסטיקס פון רנאַ זיך (דער צוקער רינג פון רנאַ האט אַ מער פֿרייַ הידראָקסיל גרופּע ווי די צוקער רינג פון דנאַ), קאַפּאַלד מיט אַ גרויס נומער פון רנאַסעס אין דער סוויווע, רנאַ איז מער אַנסטייבאַל און גרינגער צו זיין דיגריידיד ווי דנאַ.מיסט אין, מיסט אויס, אויב די קוואַליטעט פון רנאַ איז נישט גוט, די יקספּערמענאַל רעזולטאַטן מוזן זיין אַנסאַטיספאַקטערי, ספּאַסיפיקלי ארויסגעוויזן ווי ומפּינקטלעך דאַטן אָדער נעבעך ריפּיטאַביליטי.דעריבער, מער ופמערקזאַמקייט זאָל זיין באַצאָלט צו די פּראַסעסינג פון רנאַ, און די לינק פון קוואַליטעט קאָנטראָל איז אויך מער וויכטיק צו ענשור די פּינטלעכקייַט און אַקיעראַסי פון סאַבסאַקוואַנט יקספּערמענאַל דאַטן.

פֿאַר די קוואַליטעט קאָנטראָל פון רנאַ, עס זענען בכלל די פאלגענדע קאַמאַנלי געניצט מעטהאָדס:

• ספּעקטראָפאָטאָמעטרי
• אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס
• Agilent Bioanalyzer
• פאַקטיש-צייט פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר
• קוביט פלורעסאַנט פאַרב אופֿן

01 ספּעקטראָפאָטאָמעטרי

רנאַ האט קאָנדזשוגאַטעד טאָפּל קייטן און האט אַ אַבזאָרפּשאַן שפּיץ אין אַ ווייוולענגט פון 260נם.לויט לאַמבערט-ביר ס געזעץ, מיר קענען רעכענען די רנאַ קאַנסאַנטריישאַן פון די אַבזאָרפּשאַן שפּיץ ביי 260נם.אין אַדישאַן, מיר קענען אויך רעכענען די ריינקייַט פון רנאַ לויט די אַבזאָרפּשאַן פּיקס פון 260nm, 280nm און 230nm.280nm און 230nm זענען די אַבזאָרפּשאַן פּיקס פון פּראָטעינס און קליין מאַלאַקיולז ריספּעקטיוולי.די פאַרהעלטעניש פון A260/A280 און A260/A230 פון קוואַלאַפייד רנאַ ריינקייַט זאָל זיין גרעסער ווי 2. אויב עס איז ווייניקער ווי 2, עס מיטל אַז עס איז קאַנטאַמאַניישאַן פון פּראָטעין אָדער קליין מאַלאַקיול אין די רנאַ מוסטער און דאַרף זיין פּיוראַפייד ווידער.קאַנטאַמאַניישאַן קוואלן וועט ווירקן דאַונסטרים יקספּעראַמאַנץ, אַזאַ ווי ינכיבאַטינג די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט פון פּקר ריאַקשאַנז, ריזאַלטינג אין ומפּינקטלעך קוואַנטיטאַטיווע רעזולטאַטן.די ריינקייַט פון רנאַ האט אַ גרויס השפּעה אויף סאַבסאַקוואַנט רעזולטאַטן, אַזוי ספּעקטראָפאָטאָמעטרי איז בכלל אַ ינדיספּענסאַבאַל קוואַליטעט קאָנטראָל לינק אין דער ערשטער שריט אין נוקלעיק זויער יקספּעראַמאַנץ.

פיגורע 1. טיפּיש רנאַ / דנאַ אַבזאָרפּשאַן ספּעקטרום

02 אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס

אין אַדישאַן צו ריינקייַט, די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ איז אויך איינער פון די וויכטיק ינדאַקייטערז פֿאַר אויב משפטן די קוואַליטעט פון רנאַ.די דערנידעריקונג פון רנאַ וועט פירן צו אַ גרויס נומער פון קורץ פראַגמאַנץ אין דער מוסטער, אַזוי די נומער פון רנאַ פראַגמאַנץ וואָס קענען זיין יפעקטיוולי דיטעקטאַד און באדעקט דורך די רעפֿערענץ סיקוואַנס וועט זיין רידוסט.רנאַ אָרנטלעכקייַט קענען זיין אָפּגעשטעלט דורך עלעקטראָפאָרעסיס פון גאַנץ רנאַ אויף אַ 1% אַגאַראָסע געל.דער אופֿן קענען קאַנפיגיער די געל זיך, אָדער נוצן די פּריפאַבריקייטיד E-Gel ™ סיסטעם פֿאַר אָרנטלעכקייַט טעסטינג.מער ווי 80% פון גאַנץ רנאַ איז ריבאָסאָמאַל רנאַ, די מערהייַט פון וואָס איז קאַמפּאָוזד פון 28S און 18S רנאַ (אין מאַממאַליאַן סיסטעמען).גוט קוואַליטעט רנאַ וועט ווייַזן צוויי קלאָר ווי דער טאָג העל באַרס, וואָס זענען 28S און 18S העל באַרס, ריספּעקטיוולי, ביי 5 Kb און 2 Kb, און די פאַרהעלטעניש וועט טענד צו זיין נאָענט צו 2:1.אויב עס איז אין אַ דיפיוז שטאַט, עס מיטל אַז די רנאַ מוסטער קען זיין דיגריידיד, און עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן דעם אופֿן דיסקרייבד שפּעטער צו ווייַטער פּרובירן די קוואַליטעט פון רנאַ.

פיגורע 2. פאַרגלייַך פון דיגריידיד (שטעג 2) און בעשאָלעם רנאַ (שטעג 3) אויף אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס

03 אַגילענט ביאָאַנאַליזער

אין אַדישאַן צו די אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס אופֿן דיסקרייבד אויבן, וואָס קענען העלפֿן אונדז ידענטיפיצירן די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ פשוט און געשווינד, מיר קענען אויך נוצן די Agilent ביאָאַנאַליזער צו באַשטימען די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ.עס ניצט אַ קאָמבינאַציע פון ​​מיקראָפלוידיקס, קאַפּאַלערי עלעקטראָפאָרעסיס און פלואָרעססענסע צו אַססעסס רנאַ קאַנסאַנטריישאַן און אָרנטלעכקייַט.דורך ניצן די געבויט-אין אַלגערידאַם צו אַנאַלייז די פּראָפיל פון די רנאַ מוסטער, די Agilent ביאָאַנאַליזער קענען רעכענען אַ רעפֿערענץ רנאַ אָרנטלעכקייַט ווערט, רנאַ אָרנטלעכקייַט נומער (דערנאָך ריפערד צו ווי RIN) [1].די גרעסערע די ווערט פון RIN, די העכער די אָרנטלעכקייַט פון די רנאַ (1 איז גאָר דיגריידיד, 10 איז די מערסט פולשטענדיק).עטלעכע יקספּעראַמאַנץ מיט RNA פֿאָרשלאָגן ניצן RIN ווי אַ פּאַראַמעטער פֿאַר קוואַליטעט אַסעסמאַנט.די גיידליינז פון Oncomine ™ מענטשנרעכט ימיון רעפּערטואַר, וואָס איז געניצט צו דעטעקט ב צעל און ט צעל אַנטיגען ראַסעפּטערז אין Thermo Fisher's Oncomine טאַפליע סעריע, פֿאָרשלאָגן אַז סאַמפּאַלז מיט RIN וואַלועס העכער ווי 4, קענען זיין מעסטן און קלאָנעס מער עפעקטיוו.עס זענען פאַרשידענע רעקאַמענדיד ריינדזשאַז פֿאַר פאַרשידענע פּאַנאַלז, און אָפט אַ העכער RIN קענען ברענגען מער עפעקטיוו דאַטן.

פיגור 3, אין אַנקאָמינע ™ מענטשנרעכט ימיון רעפּערטואַר יקספּעראַמאַנץ, סאַמפּאַלז מיט RIN העכער ווי 4 קענען דעטעקט מער עפעקטיוו לייענען און ט צעל קלאָונז.【2】

אָבער, די RIN ווערט אויך האט עטלעכע לימיטיישאַנז.כאָטש RIN האט אַ הויך קאָראַליישאַן מיט די קוואַליטעט פון NGS יקספּערמענאַל דאַטן, עס איז נישט פּאַסיק פֿאַר FFPE סאַמפּאַלז.FFPE סאַמפּאַלז האָבן שוין כעמיש באהאנדלט פֿאַר אַ לאַנג צייַט, און די יקסטראַקטיד רנאַ בכלל האט אַ לעפיערעך נידעריק רין ווערט.אָבער, דאָס טוט נישט מיינען אַז די עפעקטיוו דאַטן פון דער עקספּערימענט מוזן זיין אַנסאַטיספאַקטערי.צו אַקיעראַטלי אַססעסס די קוואַליטעט פון FFPE סאַמפּאַלז, מיר דאַרפֿן צו נוצן אנדערע מעזשערמאַנץ ווי RIN.אין אַדישאַן צו RIN, Agilent bioanalyzer קענען אויך רעכענען DV200 ווערט ווי אַ יוואַליויישאַן פּאַראַמעטער פון רנאַ קוואַליטעט.דוו200 איז אַ פּאַראַמעטער וואָס קאַלקיאַלייץ די פּראָפּאָרציע פון ​​פראַגמאַנץ גרעסער ווי 200 בפּ אין אַ רנאַ מוסטער.DV200 איז אַ בעסער גראדן פון FFPE מוסטער קוואַליטעט ווי RIN.פֿאַר די רנאַ יקסטראַקטיד דורך FFPE, עס האט אַ זייער הויך קאָראַליישאַן מיט די נומער פון גענעס וואָס קענען זיין יפעקטיוולי דיטעקטאַד און די דייווערסיטי פון גענעס [3].כאָטש DV200 קענען ויסמעקן די דיפישאַנסיז אין די קוואַליטעט דיטעקשאַן פון FFPE, די Agilent ביאָאַנאַליזער קען נאָך נישט פולשטענדיק אַנאַלייז די קוואַליטעט פּראָבלעמס אין רנאַ סאַמפּאַלז, אַרייַנגערעכנט צי עס זענען ינכיבאַטערז אין די סאַמפּאַלז.ינכיבאַטערז זיך קענען ווירקן די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט פון דאַונסטרים יקספּעראַמאַנץ און רעדוצירן די סומע פון ​​נוציק דאַטן.צו וויסן צי עס איז אַ ינכיבאַטער אין דער מוסטער, מיר קענען אַדאַפּט די פאַקטיש-צייט פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר אופֿן דיסקרייבד ווייַטער.

04 פאַקטיש-צייט פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר

די פאַקטיש-צייט פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר אופֿן קענען ניט בלויז דעטעקט די ינכיבאַטערז אין די מוסטער, אָבער אויך אַקיעראַטלי פאַרטראַכטנ די קוואַליטעט פון רנאַ אין די FFPE מוסטער.קאַמפּערד מיט אַגילענט בייאַלאַדזשיקאַל אַנאַליזערז, פאַקטיש-צייט פלואָרעססענסע קוואַנטיטאַטיווע ינסטראַמאַנץ זענען מער פאָלקס אין הויפּט בייאַלאַדזשיקאַל לאַבאָראַטאָריעס רעכט צו זייער ברייט אַפּלאַקיישאַן.צו פּרובירן די קוואַליטעט פון רנאַ סאַמפּאַלז, מיר נאָר דאַרפֿן צו קויפן אָדער צוגרייטן אָנפאַנגער פּראָבעס פֿאַר ינערלעך רעפֿערענץ גענעס, אַזאַ ווי GUSB (Cat no. Hs00939627).דורך ניצן דעם גאַנג פון אָנפאַנגער, פּראָבעס און סטאַנדאַרדס (גאַנץ רנאַ פון באַוווסט קאַנסאַנטריישאַן) צו דורכפירן אַבסאָלוט קוואַנטיטאַטיווע יקספּעראַמאַנץ, די עפעקטיוו רנאַ פראַגמענט קאַנסאַנטריישאַן קענען זיין קאַלקיאַלייטיד ווי די עוואַלואַטיאָן נאָרמאַל פון רנאַ קוואַליטעט (פאַנגקשאַנאַל רנאַ קוואַנטיטאַטיאָן (פרק) פֿאַר קורץ).אין אַ NGS פּראָבע, מיר געפֿונען אַז די FRQ פון רנאַ סאַמפּאַלז האט אַ זייער הויך קאָראַליישאַן מיט די עפעקטיוו דאַטן באַנד.פֿאַר אַלע סאַמפּאַלז העכער ווי 0.2ng/uL FRQ, לפּחות 70% פון די לייענען קענען יפעקטיוולי דעקן די רעפֿערענץ סיקוואַנס (פיגורע 4).

פיגורע 4, די FRQ ווערט דיטעקטאַד דורך די פלורעסאַנס קוואַנטיטאַטיווע אופֿן האט אַ זייער הויך קאָראַליישאַן (R2>0.9) מיט די עפעקטיוו דאַטן באקומען אין די NGS עקספּערימענט.די רויט שורה איז די FRQ ווערט גלייַך צו 0.2 ng/uL (לאָג10 = -0.7).【4】

אין אַדישאַן צו זיין אָנווענדלעך צו FFPE סאַמפּאַלז, די פאַקטיש-צייט קוואַנטיטאַטיווע פּקר אופֿן קענען אויך יפעקטיוולי מאָניטאָר ינכיבאַטערז אין סאַמפּאַלז.מיר קענען לייגן דעם מוסטער צו זיין דיטעקטאַד אין די אָפּרוף סיסטעם מיט אינערלעכער Positive קאָנטראָל (IPC) און זייַן אַססייַ, און דעמאָלט דורכפירן פלואָרעססענסע קוואַנטאַפאַקיישאַן צו באַקומען די Ct ווערט.אויב די Ct ווערט לאַגז הינטער די Ct ווערט אין די ניט-מוסטער אָפּרוף, עס ינדיקייץ אַז די ינכיבאַטער איז פאָרשטעלן אין דער מוסטער און ינכיבאַץ די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט אין דער אָפּרוף.

05 קוביט פלורעסאַנט פאַרב אופֿן

קווביט פלואָראָמעטער איז די מערסט קאַמאַנלי געניצט קליין מיטל פֿאַר דיטעקשאַן פון נוקלעיק זויער קאַנסאַנטריישאַן און ריינקייַט, וואָס איז גרינג צו אַרבעטן און יגזיסץ אין כּמעט יעדער מאָלעקולאַר ביאָלאָגי לאַבאָראַטאָריע.עס אַקיעראַטלי קאַלקיאַלייץ די קאַנסאַנטריישאַן פון נוקלעיק זויער דורך דיטעקטינג און נוקלעיק זויער-ביינדינג פלורעסאַנט פאַרב (קווביט דיטעקשאַן רייידזשאַנט).קווביט האט הויך סענסיטיוויטי און ספּעסיפיסיטי, און קענען אַקיעראַטלי קוואַנטיפיצירן רנאַ אַראָפּ צו פּג / μL קאַנסאַנטריישאַן.אין אַדישאַן צו די געזונט-באקאנט פיייקייט צו אַקיעראַטלי קוואַנטיפיצירן די נוקלעיק זויער קאַנסאַנטריישאַן, די לעצטע נייַע מאָדעל פון Thermo Fisher, Qubit 4.0, קען אויך דעטעקט די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ.Qubit 4.0 ס רנאַ דיטעקשאַן סיסטעם (RNA IQ Assay) דיטעקץ די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ דורך סיימאַלטייניאַסלי דיטעקטינג צוויי ספּעציפיש פלורעסאַנט דיעס.די צוויי פלורעסאַנט דיעס קענען בינדן צו גרויס פראַגמאַנץ און קליין פראַגמאַנץ פון רנאַ ריספּעקטיוולי.די צוויי פלורעסאַנט דיעס אָנווייַזן די פּראָפּאָרציע פון ​​​​גרויס פראַגמאַנץ פון רנאַ אין די מוסטער, און פֿון דעם די IQ (ינטגריטי און קוואַליטי) ווערט רעפּריזענטינג די רנאַ קוואַליטעט קענען זיין קאַלקיאַלייטיד.די IQ ווערט איז אָנווענדלעך פֿאַר ביידע FFPE און ניט-FFPE סאַמפּאַלז, און האט אַ גרויס השפּעה אויף די סאַבסאַקוואַנט סיקוואַנסינג קוואַליטעט.גענומען NGS יקספּעראַמאַנץ ווי אַ ביישפּיל, אין די RNA-Seq פּרובירן יקספּעראַמאַנץ דורכגעקאָכט אויף די יאָן מאַבל ™ פּלאַטפאָרמע, רובֿ סאַמפּאַלז מיט יק וואַלועס העכער ווי 4 האט לפּחות 50% עפעקטיוו לייענען (פיגורע 5).קאַמפּערד מיט די אויבן-דערמאנט דיטעקשאַן מעטהאָדס, Qubit IQ Assay איז ניט בלויז מער באַקוועם צו אַרבעטן און נעמט ווייניקער צייט (ין פינף מינוט), אָבער אויך האט אַ גרויס קאָראַליישאַן צווישן די געמאסטן פּאַראַמעטער יק ווערט און די דאַטן קוואַליטעט פון דאַונסטרים יקספּעראַמאַנץ.

אין פיגורע 5, עס איז אַ גרויס קאָראַליישאַן צווישן די Qubit RNA IQ ווערט און די מאַפּט לייענען פון RNA-Seq.【5】

דורך די אויבן הקדמה, איך גלויבן אַז אַלעמען האט אַ גענוג פארשטאנד פון פאַרשידענע רנאַ קוואַליטעט קאָנטראָל מעטהאָדס.אין פיר, איר קענען קלייַבןדי קאָראַספּאַנדינג אופֿן לויט די מוסטער טיפּ און יגזיסטינג ינסטראַמאַנץ.בלויז דורך קאַנטראָולינג די קוואַליטעט פון רנאַ געזונט קענען מיר ויסמיידן די דורכפאַל פון סאַבסאַקוואַנט יקספּעראַמאַנץ געפֿירט דורך נעבעך מוסטער קוואַליטעט, אַזוי שפּאָרן טייַער צייט, ענערגיע און פּרייַז.

רעפערענץ פּראָדוקטן:

כייַע גאַנץ רנאַ אפגעזונדערטקייט קיט

צעל גאַנץ רנאַ אפגעזונדערטקייט קיט

רעפערענצן

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. עט על.די RIN: אַ רנאַ אָרנטלעכקייַט נומער פֿאַר אַסיינינג אָרנטלעכקייַט וואַלועס צו רנאַ מעזשערמאַנץ.במק מאָלעקולאַר ביאָל 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 אָנקאָמינע מענטשנרעכט ימיון רעפּערטוואַר באַניצער גייד (פּוב. נומ. MAN0017438 רעוו. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived from Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 3–1720 Augusthttps://doi.org/10.1093/toxsci/