מיר האָבן שוין יקספּיריאַנסט פאַבריקאַנט.ווינינג די מערהייַט אין די קריטיש סערטאַפאַקיישאַנז פון זיין מאַרק פֿאַר גרויס אַראָפּרעכענען טשיינאַ הויך סענסיטיוויטי איין-שריט זאָנד רט-Qpcrקיט וו2, קוואַליטי איז פאַבריק 'לעבן, פאָקוס אויף קונה' פאָדערונג איז דער מקור פון פירמע ניצל און אַנטוויקלונג, מיר אַדכיר צו ערלעכקייַט און גוט אמונה ארבעטן שטעלונג, קוקן פאָרויס צו דיין קומען!
מיר האָבן שוין יקספּיריאַנסט פאַבריקאַנט.ווינינג די מערהייַט אין די קריטיש סערטאַפאַקיישאַנז פון זייַן מאַרק פֿאַרטשיינאַ טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע, Qpcr, אונדזער פירמע הבטחות: גלייַך פּרייסיז, קורץ פּראָדוקציע צייט און באַפרידיקנדיק נאָך-פארקויפונג דינסט, מיר אויך באַגריסן איר צו באַזוכן אונדזער פאַבריק אין קיין צייט איר ווילט.ווינטשן מיר איצט האָבן אַ אָנגענעם און לאַנג-טערמין געשעפט צוזאַמען!!!

דיסקריפּשאַנז

דער קיט ניצט אַ יינציק ליסיס באַפער סיסטעם וואָס קענען געשווינד מעלדונג רנאַ פון געבילדעטער צעל סאַמפּאַלז פֿאַר RT-qPCR ריאַקשאַנז, און דערמיט ילימאַנייטינג די צייט-קאַנסומינג און לאַבאָריאַס רנאַ רייניקונג פּראָצעס.די רנאַ מוסטער קענען זיין באקומען אין בלויז 7 מינוט.די 5 × דירעקט רט מיקס און 2 × דירעקט qPCR מיקס-סיבר רייידזשאַנץ צוגעשטעלט דורך די קיט קענען געשווינד און יפעקטיוולי באַקומען פאַקטיש-צייט קוואַנטיטאַטיווע פּקר רעזולטאַטן.

5 × דירעקט רט מיקס און 2 × דירעקט קפּקר מיקס-סיבר האָבן שטאַרק ינכיבאַטער טאָלעראַנץ, און די ליסאַטע פון ​​די סאַמפּאַלז קענען זיין געוויינט ווי דער מוסטער פֿאַר רט-קפּקר גלייַך.דעם קיט כּולל די יינציק רנאַ הויך-פינאַטי Foregene פאַרקערט טראַנסקריפּציע, און הייס ד-טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע, dNTPs, MgCl₂, אָפּרוף באַפער, פּקר אָפּטימיזער און סטייבאַלייזער.

ספּעסאַפאַקיישאַנז

200 × 20 μל רקנס, 1000 × 20 μל רקנס

קיט קאַמפּאָונאַנץ

פֿעיִקייטן & אַדוואַנטידזשיז

■ פּשוט און עפעקטיוו: מיט Cell Direct RT טעכנאָלאָגיע, רנאַ סאַמפּאַלז קענען זיין באקומען אין בלויז 7 מינוט.

■ די מוסטער פאָדערונג איז קליין, אַזוי נידעריק ווי 10 סעלז קענען זיין טעסטעד.

■ הויך טרופּוט: עס קענען געשווינד דעטעקט רנאַ אין סעלז קאַלטשערד אין 384, 96, 24, 12, 6-געזונט פּלאַטעס.

■ דנאַ עראַסער קענען געשווינד באַזייַטיקן באפרייט גענאָמעס, זייער רעדוצירן די פּראַל אויף סאַבסאַקוואַנט יקספּערמענאַל רעזולטאַטן.

■ אָפּטימיזעד רט און קפּקר סיסטעם מאכט די צוויי-שריט רט-פּקר פאַרקערט טראַנסקריפּציע מער עפעקטיוו און פּקר מער ספּעציפיש, און מער קעגנשטעליק צו רט-קפּקר אָפּרוף ינכיבאַטערז.

קיט אַפּלאַקיישאַן

פאַרנעם פון אַפּלאַקיישאַן: געבילדעטער סעלז.

- רנאַ באפרייט דורך מוסטער ליסיס: בלויז אָנווענדלעך צו די RT-qPCR מוסטער פון דעם קיט.

- די קיט קענען ווערן גענוצט פֿאַר די פאלגענדע צוועקן: דזשין אויסדרוק אַנאַליסיס, וועראַפאַקיישאַן פון siRNA-מעדיאַטעד דזשין סילענסינג ווירקונג, מעדיצין זיפּונג, עטק.

דיאַגראַמע

סטאָרידזש און פּאָליצע לעבן

טייל איך פון דעם קיט זאָל זיין סטאָרד בייַ 4 ℃;טייל וו זאָל זיין סטאָרד בייַ -20 ℃.

פאָרעגענע פּראָטעאַסע פּלוס וו זאָל זיין סטאָרד בייַ 4 ℃, טאָן ניט פרירן ביי -20 ℃.

רעאַגענט 2 × דירעקט קפּקר מיקס-סיבר זאָל זיין סטאָרד בייַ -20 ℃ אין דער פינצטער;אויב געוויינט אָפט, עס קענען אויך זיין סטאָרד בייַ 4 ℃ פֿאַר קורץ-טערמין סטאָרידזש (נוצן זיך אין 10 טעג). מיר האָבן שוין יקספּיריאַנסט פאַבריקאַנט.ווינינג די מערהייַט אין די קריטיש סערטאַפאַקיישאַנז פון זייַן מאַרק פֿאַר גרויס אַראָפּרעכענען טשיינאַ הויך סענסיטיוויטי איין-סטעפּ פּראָבע רט-קפּקר קיט וו2, קוואַליטי איז פאַבריק 'לעבן, פאָקוס אויף קונה' פאָדערונג איז דער מקור פון פירמע ניצל און אַנטוויקלונג, מיר אַדכיר צו ערלעכקייט און גוט אמונה ארבעטן שטעלונג, קוק פאָרויס צו דיין קומען!
גרויס אַראָפּרעכענעןטשיינאַ טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע, Qpcr, אונדזער פירמע הבטחות: גלייַך פּרייסאַז, קורץ פּראָדוקציע צייט און באַפרידיקנדיק נאָך-פארקויפונג דינסט, מיר אויך באַגריסן איר צו באַזוכן אונדזער פאַבריק אין קיין צייט איר ווילט.ווינטשן מיר איצט האָבן אַ אָנגענעם און לאַנג-טערמין געשעפט צוזאַמען!!!

QuickEאַסיTM Cell Direct RT-qPCR Kit -טאַקםan

Cat.No.DRT-01021/01022

פֿאַר צעל דירעקט RT-qPCR ניצן ≤ 1000,000 סעלז

פּראָדוקט הקדמה

דער פּראָדוקט ניצט אַ יינציק ליסיס באַפער סיסטעם צו געשווינד באַפרייַען רנאַ פון געבילדעטער צעל סאַמפּאַלז פֿאַר RT-qPCR ריאַקשאַנז, ילימאַנייטינג די צייט-קאַנסומינג און לאַבאָריאַס רנאַ רייניקונג פּראָצעס, און בלויז 7 מינוט צו קריגן די פארלאנגט רנאַ מוסטער, מיט די 5× דירעקט רט מיקס, 2× דירעקט qPCR מיקס-טאַקמאַן צוגעשטעלט דורך די קיט קענען געשווינד און יפישאַנטלי באַקומען פאַקטיש-צימער רעזולטאַטן.

5× דירעקט רט מיקס און 2× דירעקט qPCR מיקס-טאַקמאַן האָבן שטאַרק ינכיבאַטער טאָלעראַנץ און קענען דורכפירן עפעקטיוו מאַפּאָלע און ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן ניצן די ליסאַטע פון ​​די מוסטער צו מעסטן ווי אַ מוסטער.דער רייידזשאַנט כּולל Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, רעאַקטיאָן באַפער, פּקר אָפּטימיזער און סטאַביליזער, וואָס קענען זיין געוויינט מיט ליסיס באַפער צו געשווינד און לייכט דעטעקט סאַמפּאַלז, און האט די קעראַקטעריסטיקס פון הויך סענסיטיוויטי, ספּעציפֿישקייט און פעסטקייַט.

פּראָדוקט פֿעיִקייטן

פּשוט, עפעקטיוו Cell Direct RT טעכנאָלאָגיע וואָס נעמט 7 מינוט צו באַקומען רנאַ סאַמפּאַלז.

מוסטער רעקווירעמענץ זענען קליין, און אַ מינימום פון 10 קאַלטשערד סעלז קענען זיין געוויינט פֿאַר יקספּעראַמאַנטיישאַן.

הויך טרופּוט פֿאַר גיך רנאַ אַקוואַזישאַן פון געבילדעטער סעלז אַזאַ ווי 384, 96, 24, 12 און 6-געזונט פּלאַטעס.

DNA Eraser איז ביכולת צו געשווינד באַזייַטיקן פריי גענאָמעס, און זייער רידוסינג די פּראַל אויף סאַבסאַקוואַנט יקספּערמענאַל רעזולטאַטן.

אָפּטימיזעד RT און qPCR סיסטעמען געבן צוויי-שריט RT-PCR מיט מער עפעקטיוו פאַרקערט טראַנסקריפּציע, ספּעציפֿישקייט און שטארקער RT-qPCR רעאַקציע ינכיבאַטער טאָלעראַנץ.

קיט אַפּלאַקיישאַן

פאַרנעם פון אַפּלאַקיישאַן: קולטור סעלז.

מוסטער ליסיס ינטערפּראַטאַד רנאַ: געניצט בלויז ווי אַ צוויי-שריט RT-qPCR מוסטער.

קיץ קענען זיין געוויינט פֿאַר די פאלגענדע צוועקן: דזשין רעגולאַטאָרי אויסדרוק אַנאַליסיס, אַללע טעסטינג, מעדיצין זיפּונג, עטק.

קיט לימיטיישאַנז

אַמפּלאַפייד פראַגמאַנץ ≤ 300 בפּ.

קיץ זענען געניצט צו פרעשלי קולטור סעלז.

פּראָדוקט קוואַליטעט קאָנטראָל

לויט די FOREGENE ס גאַנץ קוואַליטי מאַנאַגעמענט סיסטעם, יעדער פּעקל פון Cell Direct RT-qPCR סעריע קיץ איז ריגעראַסלי טעסטעד עטלעכע מאָל צו ענשור די רילייאַבילאַטי און פעסטקייַט פון די קוואַליטעט פון יעדער פּעקל פון קיץ.

קיט אינהאַלט

*:צעל ליסיס, 5 × דירעקט רט מיקס, 2 × דירעקט קפּקר מיקס-טאַקמאַן קענען זיין פּערטשאַסט סעפּעראַטלי, דעטאַילס זענען צוגעשטעלט אין אַפּפּענדיקס 1 (זייַט 13).

סטאָרידזש טנאָים

1. שיפּינג קאָנדיטיאָנס

דער גאנצער פּראָצעס פון נידעריק טעמפּעראַטור ייַז פּאַק קעסטל טראַנספּערטיישאַן, צו ענשור אַז די קיט איז אין די <4 °C שטאַט.

2. סטאָרידזש טנאָים

סטאָר טייל איך ביי 4 °C און טייל וו ביי -20 °C.

די Foregene Protease Plus II זאָל זיין סטאָרד ביי 4 °C, נישט פאַרפרוירן ביי -20 °C.

רעאַגענט 2 × דירעקט קפּקר מיקס-טאַקמאַן איז סטאָרד ביי -20 ° C, אָדער בייַ 4 ° C פֿאַר קורץ-טערמין נוצן אויב אָפט געניצט (ין 10 טעג).

קיט קאָמפּאָנענט אינפֿאָרמאַציע

Buffer CL: פּראָווידעס די סוויווע פארלאנגט פֿאַר צעל ליסיס ריאַקשאַנז.

Buffer ST: טערמינאַטעס די אַקטיוו מאַטעריע אין די ליסאַטע צו ויסמיידן יפעקץ אויף סאַבסאַקוואַנט רט.

דנאַ מעקער: דנאַ רימוווער, די ווירקונג פון רימוווינג די גענאָמע אויף סאַבסאַקוואַנט יקספּעראַמאַנץ.

5 × דירעקט רט מיקס: כּולל הויך רנאַ קירבות פאָרעגענע פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע, רנאַסע ינכיבאַטער, דנטפּס, סטייבאַלייזערז, ענכאַנסערז, אָפּטימיזערס און פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּרימערז פֿאַר אָפּטימאַל אַליינמאַנט (ראַנדאָם אָנפאַנגער, אָליגאָ (דט)₁₈אָנפאַנגער).

פאָרעגענע פּראָטעאַסע פּלוס וו: אין דעם קאָנטעקסט פון ליסיס באַפער, סעלז זענען ליסעד צו מעלדונג נוקלעיק אַסאַדז.

2 × דירעקט qPCR מיקס-טאַקמאַן: דער רייידזשאַנט כּולל הייס ד-טאַק דנאַ פּאָלימעראַסע, דנטפּס, מגקל₂, אָפּרוף באַפער, פּקר אָפּטימיזער און סטייבאַלייזער.

20 × ROX רעפערענץ פאַרב: בכלל געניצט אויף פאַקטיש צייט פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן ינסטראַמאַנץ פון אַבי, סטראַטאַגענע און אנדערע קאָמפּאַניעס, עס איז געניצט צו סטרויערן די חילוק צווישן פּקר טובז און טובז געפֿירט דורך פּקר דאָוסינג ערראָרס.די 20 × ROX רעפערענץ פאַרב קאַנסאַנטריישאַן פארלאנגט פֿאַר פאַרשידענע ינסטראַמאַנץ איז אַנדערש, און דער באַניצער קענען לייגן עס לויט די רעקאַמענדיד קאַנסאַנטריישאַן פון די קיילע.

RNase-Free ddH₂אָ: רנאַסע-פריי סטעראַלייזד הינטער ריין וואַסער פֿאַר צוויי-שריט RT-qPCR ריאַקשאַנז.

מאסנאמען:(זייט זיכער צו לייענען די פּריקאָשאַנז קערפאַלי איידער איר נוצן די קיט)

באַצאָלן ופמערקזאַמקייַט צו די אָפּעראַציע אופֿן פון דער עקספּערימענט צו ויסמייַדן קרייַז-קאַנטאַמאַניישאַן צווישן סאַמפּאַלז.

באַצאָלן ופמערקזאַמקייַט צו די ריינקייַט פון די יקספּערמענאַל סוויווע און יוטענסאַלז צו ויסמיידן רנאַסע קאַנטאַמאַניישאַן און רנאַ דערנידעריקונג.

נעמען פריש אָדער געזונט-אפגעהיט צעל סאַמפּאַלז און קיינמאָל נוצן ריפּיטיד פרירן-טאָוד צעל סאַמפּאַלז.

5 × דירעקט קפּקר מיקס, 2 × דירעקט קפּקר מיקס-טאַקמאַן זאָל ויסמיידן ריפּיטיד פרירן-טאָ, אַנדערש עס וועט ווירקן פאַרקערט טראַנסקריפּציע און פּקר עפעקטיווקייַט.

פּרעפּאַראַשאַנזפריעראָפּעראַציע

זייט זיכער צו לייענען די ינסטראַקשאַנז קערפאַלי איידער איר נוצן דעם קיט.די Cell Direct RT-qPCR קיט איז פּשוט, באַקוועם און שנעל צו אַרבעטן, און די ינסטראַקשאַנז צושטעלן פולשטענדיק אינפֿאָרמאַציע וועגן די גאנצע קיט און ווי צו נוצן עס ריכטיק.ביטע צוגרייטן די נייטיק יקספּערמענאַל מאַטעריאַלס און ויסריכט איידער נוצן.

עקספּערימענטאַל מאַטעריאַלס און ויסריכט

◆ קולטור סעלז.

◆ 1.5 מל אָדער 2 מל, רנאַסע-/דנאַסע-פֿרייַ סענטריפודזש רער, רנאַסע-/דנאַסע-פֿרייַ שפּיץ, 0.2 מל סטערילע קפּקר רער.

◆ קפּקר מאַשין, פּייפּעט, טאַבלעטאָפּ סענטריפוגע (≥13,400×ז) (דיפּענדינג אויף יקספּערמענאַל באדערפענישן), אאז"ו ו.

זיכערקייַט

◆ דעם פּראָדוקט איז בלויז פֿאַר וויסנשאפטלעכע פאָרשונג צוועקן, ביטע טאָן ניט נוצן עס פֿאַר פאַרמאַסוטיקאַל, קליניש, עסנוואַרג און קאָסמעטיק צוועקן.

◆ ווען ניצן קעמיקאַלז, טראָגן צונעמען לאַב קליידער, גלאַווז, פּראַטעקטיוו ברילן, אאז"ו ו.

אָפּעראַציעפירער

צעל ליסיס סיסטעמען, RT סיסטעמען און qPCR רעאַקציע לייזונג העסאָפע פּאַקס קענען זיין פּערטשאַסט סעפּעראַטלי, פֿאַר דעטאַילס אין אַפּפּענדיקס 1 (זייַט 13).

אָפּעראַציע פירער

א: מוסטער רנאַ מעלדונג

1. סעלז זענען פּרעטרעאַטעד: וואַשן די צעל קולטור טעלער מיט קאַלט פּבס, און ליס די סעלז (10-10)⁶), 10⁶ ווי די סומע פון ​​סעלז, עס איז רעקאַמענדיד צו פאָרגעט די צעל אַ רנאַ יזאָלאַטיאָן קיט די גאַנץ (DE-03111) אָדער כייַע גאַנץ רנאַ יסאָלאַטיאָן קיט (DE-03011) פֿאַר רנאַ יקסטראַקשאַן און רייניקונג.

1.1.אַדכיראַנט סעלז (24- געזונט טעלער ווי אַ בייַשפּיל)

1.1.1.באַשטימען די נומער פון סעלז אין יעדער געזונט, באַשטימען אַז די נומער פון סעלז איז 1 × 10⁵, און נוצן אַ פּייפּעט צו באַזייַטיקן די קולטור מיטל פון די קולטור שיסל.

1.1.2.לייג 200 μל פון פאַר-קילד 1 × PBS צו יעדער געזונט.דו זאלסט נישט פּיפּעטן ריפּיטידלי און באַזייַטיקן PBS פון די וועלז.טילט די טעלער און אַראָפּנעמען ווי פיל PBS ווי מעגלעך.גיינ ווייַטער צו שריט 2.

1.1.3.פאַרשידענע צעל קולטור שיסל אָדער אַ רעפֿערענץ נומער טיש 1-1 אין אַ צעל קולטור שיסל איז צוגעגעבן פּריקאָולד 1 × PBS פֿאַר צעל וואַשינג.

טאַבלע 1-1: פּבס דאָוסאַדזש פֿאַר פאַרשידענע נומער פון סעלז

נאטיץ:צו ענשור אַ פעסט אַדכיראַנט סעלז,אַ גרויס נומער פון צעל אָנווער אַוווידיד ווען וואַשינג.

1.2.סאַספּענשאַן סעלז אָדער אַדכיראַנט סעלז קאַלטשערד אין ניט-פּאָרעז פּלאַטעס

1.2.1.אַדכיראַנט סעלז קאַלטשערד אין ניט-מאַלטי געזונט פּלאַטעס (סאַספּענשאַן סעלז אָנהייבן פֿון דער ווייַטער שריט 1.2.2), קלייַבן און באַזונדער די סעלז לויט די נאָרמאַל צעל זאַמלונג אופֿן, און שטעלן זיי אין אַ קולטור טעלער אָדער סענטריפודזש רער;אויב טריפּסיניזאַטיאָן איז געניצט, דאַרפן סענטריפוגיישאַן צו זאַמלען די סעלז און צו באַזייַטיקן ריזידזשואַל טריפּסין, צוגעגעבן PBS ריסאַספּאַנדיד סעלז אין יחיד סעלז צו צעשפּרייטן די סעלז.

1.2.2.נאָך די נומער פון סעלז גערעכנט, אַליקוואָטעד סעלז 1 × 10⁵ איינער צו סענטריפודזש טובז, קלייַבן סעלז דורך סענטריפוגיישאַן בייַ 1000 × ג פֿאַר 10 מינוט.

1.2.3.לייג 200 μל פּבס צו די סענטריפודזש רער, טאָן ניט פּיפּעטן ריפּיטידלי און גלייַך אַספּירירן די פּבס.גיינ ווייַטער צו שריט 2. (אויב שווער צו אָפּזעצן און די סעלז זענען ריסאַספּאַנדיד ווידער, 1000 × ג סענטריפוגעד 10 מינוט נאָך דיסקאַרדינג די סופּערנאַטאַנט, די צעל פּעלאַץ גיינ ווייַטער צו שריט 2)

2. צעל ליסיס: אַראָפּנעמען Buffer CL, זייַן טעמפּעראַטור יקוואַליברייטיד צו צימער טעמפּעראַטור, דנאַ עראַסער און פאָרעגענע פּראָטעאַסע פּלוס וו, לויט די פאלגענדע טיש 1-2 צוגעגרייט ליסיס סיסטעם: (ליסיס לייזונג איז גרייט פֿאַר נוצן).

טאַבלע 1-2: קלעאַוואַגע סיסטעם צוגרייטונג (באַמערקונג: אין דער צוגרייטונג אויף אייז)

3.(24-געזונט טעלער ווי אַ בייַשפּיל) פּיפּעטט 200 μל פון צעל ליסיס בעל מישן אין יעדער געזונט, ריפּיטידלי קלאַפּ 5-10 מאל, ינקובאַטע אין צימער טעמפּעראַטור (20-25 ℃) פֿאַר 5 מינוט.

נאטיץ:צו ויסמיידן די פאָרמירונג פון באַבאַלז, ווען די פּיפּעטטינג וואָג איז אַדזשאַסטיד צו 200μל אָדער ווייניקער.די סעלז קענען זיין פאַרוואָלקנט נאָך ליסיס, וואָס איז נאָרמאַל.

4.(24-געזונט טעלער ווי אַ בייַשפּיל) איז מוסיף אין די פליסיק 20 μl Buffer ST (פאַרשידענע ליסיס סיסטעמען Buffer ST צוגעגעבן אין אַ סומע געוויזן אין טאַבלע 1-3), ריפּיטיד פּיפּעטטינג 5-10 מאל, אין צימער טעמפּעראַטור (20-25 ℃) זענען ינקובייטיד פֿאַר 2 מין.

נאטיץ:די פּיפּעטטע שפּיץ דיספּאָוזד אונטער די ייבערפלאַך, ינשורינג אַז די ליסאַטע איז צוגעגעבן,צו ויסמיידן די פאָרמירונג פון באַבאַלז, ביטע ווען די פּיפּעטטינג וואָג איז אַדזשאַסטיד צו 200μל אָדער ווייניקער.

טיש 1-3:לייג Buffer ST

5. די ליסאַטע איז געניצט פֿאַר סאַבסאַקוואַנט רט-קפּקר יקספּעראַמאַנץ.אויב די סאַבסאַקוואַנט יקספּעראַמאַנץ קענען ניט זיין דורכגעקאָכט אין צייט, ביטע האַלטן עס אויף אייז פֿאַר ניט מער ווי 2 שעה און קראָם ביי -20 ℃ אָדער -80 ℃ (ניט מער ווי דריי חדשים).

ב: רט סיסטעם צוגרייטונג

1.נעמען אויס 5 × דירעקט רט מיקס און שטעלן עס אויף אַן אייז וואַנע, לאָזן עס צעשמעלצן געוויינטלעך, און דזשענטלי מישן עס פֿאַר שפּעטער נוצן;נעמען אויס RNase-Free ddH2O און צעשמעלצן עס און שטעלן עס אויף אַן אייז וואַנע פֿאַר שפּעטער נוצן.צוגרייטן די אָפּרוף סיסטעם אויף אייז לויט טאַבלע 2-1 אונטן.

טיש 2-1: צוגרייטונג פון רט אָפּרוף סיסטעם

2. נאָך קאַמפּלישאַן פון סיסטעם פאָרמיוליישאַן, דזשענטלי געמישט און סענטריפוגעד בעקיצער אין די פאלגענדע טיש 2 -2 אָפּרוף טנאָים רט אָפּרוף.

טיש 2-2: רט רעאַקטיאָן צושטאַנד באַשטעטיקן

3.נאָך קאַמפּלישאַן פון דער אָפּרוף, דער אָפּרוף פּראָדוקט איז געשטעלט גלייַך אויף אייז פֿאַר קפּקר, ביטע שטעלן די לאַנג-טערמין פּרעזערוויישאַן -20 ℃ אָדער -80 ℃.

באַמערקונג: רעכט צו דער נוצן פון ניט-פּיוראַפייד מוסטער, ווייַס פּרעסיפּיטאַטעס קען דערשייַנען אין די פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּראָדוקט.דאָס איז אַ נאָרמאַל דערשיינונג.סענטריפיודזש די סופּערנאַטאַנט מיד פֿאַר סאַבסאַקוואַנט יקספּעראַמאַנץ.

די ריזאַלטינג RT אָפּרוף לייזונג איז מוסיף צו דער ווייַטער סטעפּ רעאַל צייט פּקר אָפּרוף סיסטעמען, עס איז רעקאַמענדיד צו לייגן אַמאַונץ ריינדזשינג פון 10-30% פון די אָפּרוף סיסטעם.

C: qPCR אָפּרוף סיסטעם צוגרייטונג

1. צונעמען סומע פון ​​ב צוגעגרייט אין שריט קדנאַ מוסטער לויט די פאלגענדע טיש 3-1 צו צוגרייטן אַ אָפּרוף סיסטעם.

באַמערקונג: די סומע פון ​​​​קדנאַ מוסטער אַקאַונץ פֿאַר 10-30% פון די qPCR סיסטעם.פֿאַר בייַשפּיל, אין אַ 20μl qPCR סיסטעם, לייגן 2-6 μl פון ליסיס באַפער, אָבער נישט מער ווי 6 μl.

2.די אַפּטאַמאַזיישאַן גוט קפּקר טנאָים (אַנניאַלינג טעמפּעראַטור, אאז"ו ו) פֿאַר קפּקר אָפּרוף (די אָפּרוף טנאָים געגעבן אין טיש 3-2).

באַמערקונג: פּרוּווט צו נוצן אָפּטימיזעד טנאָים פֿאַר qPCR ריאַקשאַנז צו באַקומען בעסער רעזולטאַטן.

טיש 3-1: צוגרייטונג פון פּקר אָפּרוף סיסטעם

1 *: אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן קענען זיין אַדזשאַסטיד אין די קייט פון 50-900 נם ווען אָנפאַנגער אָפּרוף פאָרשטעלונג איז נעבעך.

באַמערקונג: די qPCR סיסטעם קענען זיין אַדזשאַסטיד לויט צו יקספּערמענאַל באדערפענישן און פלורעסאַנס סייקאַלער מאָדעל.פֿאַר qPCR אין אַ 50μl סיסטעם, סטרויערן די רייידזשאַנט דאָוסאַדזש פּראַפּאָרשנאַלי לויט די 20μl סיסטעם.

2 *: אויסקלייַבן די צונעמען לעצט קאַנסאַנטריישאַן פון ROX רעפערענץ פאַרב לויט די פלואָרעססענסע קוואַנטיטאַטיווע טערמאַל סייקאַלער.די מערסט צונעמען ROX רעפערענץ פאַרב קאַנסאַנטריישאַנז פֿאַר פּראָסט פלואָרעססענסע קוואַנטיטאַטיווע סייקאַלז זענען געוויזן אין די טיש אונטן:

טיש 3-2: qPCR אָפּרוף טנאָים זענען צוגעשטעלט

באַמערקונג: צו באַקומען די בעסטער qPCR ווירקונג, גראַדיענט פּקר קענען זיין געוויינט צו אַפּטאַמייז די אָפּרוף טנאָים פֿאַר פאַרשידענע טעמפּלאַטעס און פאַרשידענע אָנפאַנגערס.פּקר רעאַקציע טנאָים בייַטן דיפּענדינג אויף די פלואָרעססענסע אַנאַליזער, מוסטער, אָנפאַנגער, אאז"ו ו. אין דער ספּעציפיש אָפּעראַציע, די אָפּטימאַל אָפּרוף טנאָים דאַרפֿן צו זיין דיזיינד לויט די ספּעציפיש טנאָים פון די פלואָרעססענסע קוואַנטיטאַטיווע טערמאַל סייקאַלער, מוסטער טיפּ, גרייס פון דעם פראַגמענט פון אינטערעס, באַזע סיקוואַנס פון די אַמפּלאַפייד פראַגמענט און גק אינהאַלט און לענג פון אָנפאַנגער, אַרייַנגערעכנט רעאַקציע צייט, עטק.

פאַקטיש צייט פּקר אָנפאַנגער פּלאַן פּרינסאַפּאַלז

פאָרויס אָנפאַנגער און פאַרקערט אָנפאַנגער

פֿאַר פאַקטיש צייט פּקר, אָנפאַנגער פּלאַן איז זייער וויכטיק.פּרימערז זענען שייַכות צו די ספּעציפֿישקייט און עפעקטיווקייַט פון פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן, און קענען זיין דיזיינד מיט די פאלגענדע פּרינסאַפּאַלז:

◆ אָנפאַנגער לענג: 18-30בפּ.

◆ גק צופרידן: 40-60%.

◆ טם ווערט: אָנפאַנגער פּלאַן ווייכווארג, אַזאַ ווי אָנפאַנגער 5, קענען געבן די טם ווערט פון די אָנפאַנגער.די טם וואַלועס פון די אַפּסטרים און דאַונסטרים פּרימערז זאָל זיין ווי נאָענט ווי מעגלעך.די טם כעזשבן פאָרמולע קענען אויך זיין געוויינט: טם = 4 °C (ג + C) + 2 °C (א + ה).ווען פּערפאָרמינג פּקר, אַ טעמפּעראַטור אונטער די אָנפאַנגער טם ווערט פון 5 °C איז בכלל אויסגעקליבן ווי די אַנילינג טעמפּעראַטור (די קאָראַספּאַנדינג פאַרגרעסערן אין די אַנילינג טעמפּעראַטור קענען פאַרגרעסערן די ספּעסיפיקייט פון די פּקר אָפּרוף).

◆ פּרימערז און פּקר פּראָדוקטן:

◆ פּלאַן אָנפאַנגער פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט לענג איז פּרעפעראַבלי 100-150בפּ.

◆ פּלאַן פּרימערז אין די צווייטיק סטראַקטשעראַל געגנט פון די מוסטער זאָל זיין אַוווידיד ווי פיל ווי מעגלעך.

◆ ויסמיידן די פאָרמירונג פון 2 אָדער מער קאַמפּלאַמענטשי באַסעס צווישן די 3′ ענדס פון אַפּסטרים און דאַונסטרים פּרימערז.

◆ אָנפאַנגער 3′ וואָקזאַל באַזע קענען ניט זיין פאָרשטעלן מיט 3 נאָך קאָנסעקוטיווע G אָדער C.

◆ די אָנפאַנגערס זיך קענען נישט האָבן קאַמפּלאַמענטשי סטראַקטשערז, אַנדערש אַ האַירפּין סטרוקטור וועט זיין געשאפן, אַפעקטינג פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן.

◆ ATCG זאָל זיין פונאנדערגעטיילט ווי יוואַנלי ווי מעגלעך אין די אָנפאַנגער סיקוואַנס, און די 3′ וואָקזאַל באַזע זאָל זיין אַוווידאַד ווי ט.

אַפּפּענדיקס1:Cעל דירעקטRT-qPCR קיט קאָמפּאָנענטה העסאָפע פּאַק

1.צעל ליסיס לייזונג