RT-qPCR עקספּערימענט כולל רנאַ יקסטראַקשאַן און קוואַליטעט אַסעסמאַנט, פאַרקערט טראַנסקריפּציע און qPCR דריי סטעפּס, יעדער שריט האט אַ פּלאַץ פון פּריקאָשאַנז, מיר וועלן פאָרשטעלן אין דעטאַל אונטן.

Ⅰ.אַסעסמאַנט פון רנאַ קוואַליטעט

אין RT-qPCR עקספּערימענט, נאָך די קאַמפּלישאַן פון רנאַ יקסטראַקשאַן, די קוואַליטעט פון רנאַ דאַרף זיין עוואַלואַטעד, און די נאָכפאָלגן עקספּערימענט קענען זיין דורכגעקאָכט בלויז נאָך עס איז קוואַלאַפייד.אפשאצונג מעטהאָדס אַרייַננעמען ספּעקטראָפאָטאָמעטער, אַגילענט געל עלעקטראָפאָרעסיס, אַגילענט 2100 אַנאַליסיס, צווישן וואָס די מערסט קאַמאַנלי געוויינט ספּעקטראָפאָטאָמעטער און אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס דיטעקשאַן.עס זאָל זיין אנגעוויזן אַז די צוויי מעטהאָדס דאַרפֿן צו זיין געוויינט צוזאַמען צו פאַרענדיקן די דיטעקשאַן און אַנאַליסיס פון רנאַ קאַנסאַנטריישאַן, ריינקייַט און אָרנטלעכקייַט, אַזוי צו ענשור די קוואַליטעט פון רנאַ.

פֿאַרבונדענע RNA Isolation Kit: 

צעל גאַנץ רנאַ אפגעזונדערטקייט קיט

העכסט פּיוראַפייד און הויך-קוואַליטעט גאַנץ רנאַ קענען זיין באקומען פון פאַרשידן קאַלטשערד סעלז אין 11 מינוט.

כייַע גאַנץ רנאַ אפגעזונדערטקייט קיט

געשווינד און יפישאַנטלי עקסטראַקט הויך-ריינקייט און הויך-קוואַליטעט גאַנץ רנאַ פון פאַרשידן כייַע געוועבן.

ספּעקטראָפאָטאָמעטער:

די ספּעקטראָפאָטאָמעטער איז דער הויפּט געניצט צו באַשטימען די קאַנסאַנטריישאַן און ריינקייַט פון רנאַ, אָבער עס קען נישט דעטעקט די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ און גענאָמיק רעזאַדו.צווישן זיי, A260/280 און A260/230 זענען וויכטיק פּאַראַמעטערס פֿאַר רנאַ ריינקייַט דיטעקשאַן, און רנאַ ריינקייַט קענען זיין דיטעקטאַד לויט די פלאַקטשויישאַן פון זייער וואַלועס:

1. 1.9 < אַ260/280 < 2.1, ינדאַקייטינג אַז רנאַ ריינקייַט איז גוט;A260/280 <1.9, ינדאַקייטינג אַז עס קען זיין פּראָטעין רעזאַדו אין רנאַ;A260/280>2.1, ינדאַקייטינג מעגלעך פּאַרטיייש דערנידעריקונג פון רנאַ, וואָס קענען זיין ווייַטער באשטעטיקט דורך אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.

2. 2.0 < אַ260/230 < 2.2, ינדאַקייטינג אַז רנאַ ריינקייַט איז גוט;A260/230 <2.0, וואָס ינדיקייץ אַז עס קען זיין רעזאַדוז פון אָרגאַניק רייידזשאַנץ אין רנאַ, אַזאַ ווי פענאָלס, עטאַנאָל אָדער שוגערז.

אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס:

אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס אַסייַי קענען פונאַנדערקלייַבן רנאַ אָרנטלעכקייַט, גענאָמע און פּראָטעין רעזאַדוז, אָבער קענען נישט אַקיעראַטלי קוואַנטיפיצירן די קאַנסאַנטריישאַן פון רנאַ אָדער דעטעקט די רעזאַדוז פון אָרגאַניק רייידזשאַנץ.נעמען עוקאַריאָטיק רנאַ טעמפּלאַטעס פֿאַר בייַשפּיל:

1. די רנאַ איז געווען אונטערטעניק צו אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.אויב עס זענען בלויז דריי איין באַנדס פון 28sRNA, 18sRNA און 5.8sRNA אויף די געל מאַפּע, עס ינדיקייץ אַז די יקסטראַקטיד רנאַ איז בעשאָלעם.אויב עס איז אַ דראַגינג דערשיינונג, עס ינדיקייץ פּאַרטיייש דערנידעריקונג פון רנאַ.

2. אויב עס איז אַ איין העל באַנד צווישן די קליי לאָך און די 28סרנאַ באַנד, עס קען זיין גענאָמיק דנאַ רעזאַדו.

3. אויב באַנדס דערשייַנען אין די קליי לאָך, עס ינדיקייץ אַז עס קען זיין רעזאַדוז פון פּראָטעין און אנדערע מאַקראָמאָלעקולאַר סאַבסטאַנסיז.

Ⅱ. פאַרקערט טראַנסקריפּציע

נאָך רנאַ יקסטראַקשאַן איז געענדיקט, עס דאַרף זיין ריווערסט אין cDNA פֿאַר סאַבסאַקוואַנט יקספּעראַמאַנץ, אַזוי די מאַפּאָלע שריט איז יקערדיק.פאַרקערט טראַנסקריפּציע וועט זיין באַקענענ פון די סעלעקציע פון ​​​​פאַרקערט טראַנסקריפּציע און אָנפאַנגער:

פאַרקערט טראַנסקריפּציע סעלעקציע:

די טיפּיש פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסאַז אַרייַננעמען AMV RTase און MMLV RTase.די RNase H פון AMV RTase האט שטאַרק טעטיקייט, קורץ סינטעז לענג, נידעריק סינטעז סומע און גוט טערמאַל פעסטקייַט (42 ~ 55 ℃).די RNase H טעטיקייט פון MMLV RTase איז שוואַך, די סינטעז לענג איז לאַנג, די סינטעז סומע איז הויך און די טערמאַל פעסטקייַט איז נעבעך (37 ~ 42 ℃).

ווייַל רנאַסע ה ענזיים האט די פונקציע פון ​​דיגריידינג רנאַ מוסטער, MMLV מיט שוואַך רנאַסע ה טעטיקייט זאָל זיין פּרעפערענטשאַלי אויסגעקליבן בעשאַס פאַרקערט טראַנסקריפּציע, און נאָך שפּעטער גענעטיק ינזשעניעריע, די טערמאַל פעסטקייַט פון MMLV האט ריטשט אַ קוואַליטאַטיווע שפּרינגען.גענומען פאָרעגענעפאָרעאַסי פאַרקערט טראַנסקריפּציע (M-MLV פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע) ווי אַ ביישפּיל, עס איז אַ נייַע פאַרקערט טראַנסקריפּציע אויסגעדריקט אין E. קאָלי ענדזשאַנירד באַקטיריאַ ניצן גענעטיק רעקאָמבינאַטיאָן טעכנאָלאָגיע.עס איז אַ רעקאָמבינאַנט דנאַ פּאָלימעראַסע אַז סינטאַסייזיז אַ קאַמפּלאַמענטשי דנאַ שנירל פון איין-סטראַנדיד רנאַ, דנאַ אָדער אַ רנאַ: דנאַ כייבריד.עס האט קיין RNAse H טעטיקייט, שטאַרק פעסטקייַט, שטאַרק רנאַ קירבות און הויך דיטעקשאַן סענסיטיוויטי.

 

פאָרעאַסי פאַרקערט טראַנסקריפּציע (M-MLV פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע)

סעלעקציע פון ​​​​אָנהייב:

אין אַלגעמיין, RT פּרימערז פאַלן אין דריי קאַטעגאָריעס: oligo dT, טראַפ - פּרימערז און דזשין-ספּעציפיש פּרימערז.אויסקלייַבן פּאַסיק פּרימערז פֿאַר נוצן לויט פאַרשידענע יקספּערמענאַל רעקווירעמענץ.

1. אויב דער מוסטער איז פון עוקאַריאָטיק אָנהייב און די שפּעט קדנאַ איז געניצט פֿאַר רוטין פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן, אָליגאָ (דט) איז רעקאַמענדיד;אויב די סאַבסאַקוואַנט עקספּערימענט איז בלויז געניצט פֿאַר qPCR, Oligo (dT) איז רעקאַמענדיד צו זיין געמישט מיט טראַפ פּרימערז צו פֿאַרבעסערן די עפעקטיווקייַט פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע.

2. אויב דער מוסטער איז פֿון פּראָקאַריאָטעס, ראַנדאָם פּרימערז אָדער דזשין ספּעציפיש פּרימערז זאָל זיין אויסגעקליבן פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע.

Ⅲ.qPCR

פלואָרעססענסע קוואַנטאַפאַקיישאַן איז דער הויפּט ילאַבערייטיד פון די סעלעקציע פון ​​קוואַנטיטאַטיווע מעטהאָדס, אָנפאַנגער פּלאַן פּרינסאַפּאַלז, ROX סעלעקציע, אָפּרוף סיסטעם קאַנפיגיעריישאַן און אָפּרוף טנאָים באַשטעטיקן, עטק.

סעלעקציע פון ​​קוואַנטיטאַטיווע מעטהאָדס:

קוואַנטיטאַטיווע מעטהאָדס זענען צעטיילט אין רעלאַטיוו קוואַנטיטאַטיווע מעטהאָדס און אַבסאָלוט קוואַנטיטאַטיווע מעטהאָדס.קאָרעוו קוואַנטיפיקאַטיאָן קענען זיין געניצט צו דעטעקט די ווירקונג פון זיכער באַהאַנדלונג מעטהאָדס אויף דזשין אויסדרוק, דעטעקט די חילוק פון דזשין אויסדרוק אין פאַרשידענע צייט און פאַרגלייַכן די חילוק פון דזשין אויסדרוק אין פאַרשידענע געוועבן.אַבסאָלוט קוואַנטיפיקאַטיאָן קענען דעטעקט די סומע פון ​​​​נוקלעיק זויער אין די ווירוס און אַזוי אויף.ווען מיר טאָן יקספּעראַמאַנץ, מיר מוזן קלייַבן די צונעמען קוואַנטיטאַטיווע מעטהאָדס לויט אונדזער אייגענע יקספּעראַמאַנץ.

פּרינסאַפּאַלז פון אָנפאַנגער פּלאַן:

דער פּלאַן פון אָנפאַנגער פֿאַר qPCR איז גלייַך שייַכות צו די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט און פּראָדוקט ספּעסיפיקאַטי.דעריבער, ריכטיק דיזיינינג גוט פּרימערז איז דער ערשטער שריט פון מצליח qPCR.אין דער פּלאַן פון אָנפאַנגער, די פאלגענדע פּרינסאַפּאַלז זאָל זיין אכטונג צו ווען איר טרעפן דעם פּרינציפּ פון קאַנווענשאַנאַל אָנפאַנגער פּלאַן:

1. די לענג פון די ציל פראַגמענט איז קאַנטראָולד צווישן 100 און 300 בפּ;

2. קרייַז-עקסאָן פּלאַן צו ויסמייַדן די השפּעה פון גענאָמיק דנאַ;

3. די דיזיינד אָנפאַנגערס דאַרפֿן צו זיין טעסטעד פֿאַר אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט, און בלויז ווען די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט ריטשאַז די נאָרמאַל (90-110%) קענען זיין געוויינט פֿאַר קוואַנטיטאַטיווע יקספּעראַמאַנץ;

4. אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן איז יוזשאַוואַלי אָפּטימיזעד צווישן 0.1um און 1.0um.

סעלעקציע פוןROX:

אין דעם פּראָצעס פון קוואַנטיטאַטיווע אָפּרוף, ROX קענען סטרויערן די אָפּטיש דרך חילוק, פּיפּעטטינג טעות אָדער באַנד חילוק געפֿירט דורך יוואַפּעריישאַן און קאַנדאַנסיישאַן יונאַפאָרמלי, ימפּרוווינג די ריפּיטאַביליטי פון די רעזולטאַטן.אָבער, עס זאָל זיין אנגעוויזן אַז די סעלעקציע פון ​​ROX איז שייך צו די קיילע.אויב די qPCR קיילע האט די פֿונקציע פון ​​אויטאָמאַטיש קערעקטינג די חילוק צווישן האָלעס, עס טוט נישט דאַרפֿן צו לייגן ROX;אַנדערש, עס דאַרף צו לייגן ROX קערעקשאַן.קליין פּאַרטנערס אין בייינג רייידזשאַנץ מוזן זיין לויט צו די קיילע געניצט צו קלייַבן די ריכטיק ROX, ויסמיידן שפּעטער מיסטייקס.

צוגרייטונג פון רעאַקציע סיסטעם:

רעאַקציע וואַליומז פון 20ul און 50ul זענען בילכער.די פאלגענדע זאכן זאָל זיין אכטונג צו ווען די סיסטעם איז פארמולירט:

1. דער אָפּרוף סיסטעם דאַרף זיין צוגעגרייט דורך ווענאַליישאַן אין די הינטער-ריין וואָרקבענטש, נייַ דה₂אָ איז געניצט פֿאַר יעדער עקספּערימענט;

2. יעדער עקספּערימענט דאַרף צוגרייטן נטק צו באַשטעטיקן צי עס איז פאַרפּעסטיקונג אין די סיסטעם, און יעדער פּאָר פון אָנפאַנגער דאַרף טאָן נטק ווען פּריפּערינג די סיסטעם;

3. צו דעטעקט צי עס איז גדנאַ רעזאַדו אין די רנאַ מוסטער, NRT קענען זיין צוגעגרייט פֿאַר יעדער מוסטער פֿאַר דיטעקשאַן;

4. ווען פּריפּערינג די סיסטעם, עס איז רעקאַמענדיד צו טאָן בייַ מינדסטער 3 טעכניש ריפּיץ פֿאַר איין מוסטער;

5. ווען דער מוסטער איז cDNA, עס איז רעקאַמענדיד צו צעפירן 5-10 מאל צו רעדוצירן די ינאַבישאַן ווירקונג פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע סיסטעם אויף qPCR עקספּערימענט.עס איז בעסער צו ויספאָרשן די מוסטער קוואַנטיטי דורך גראַדיענט, אַזוי אַז די קאָרט ווערט פאלן צווישן 20-30;

6. באַשטימען די פארלאנגט נומער פון ריאַקשאַנז, פאַרגרעסערן דורך 5-10% אויף דער באזע פון ​​די נומער פון ריאַקשאַנז, און רעכענען די באַנד קאַנפיגיעריישאַן נומער;

7, די סיסטעם איז צוגעגרייט מיט די פּרימיקס פּרינציפּ, מיקסינג נאָך סענטריפוגיישאַן און ענשור קיין באַבאַלז;

8, ווי ווייַט ווי מעגלעך צו קלייַבן שטיצן קאָנסומאַבלעס.

פֿאַרבונדענע רט-קפּקר קיט