ספּעסיפיקאַטי פון דיטעקשאַן

אין רובֿ קאַסעס, דער ציל פון אָנפאַנגער פּלאַן איז צו מאַקסאַמייז די ספּעסיפיסיטי פון פּקר.דעם איז באשלאסן דורך די מער אָדער ווייניקער פּרידיקטאַבאַל השפּעה פון פילע וועריאַבאַלז.איינער וויכטיק בייַטעוודיק איז די סיקוואַנס אין די 3′ סוף פון די אָנפאַנגער.

ימפּאָרטאַנטלי, פּקר אַסאַסאַז דיזיינד פֿאַר ספּעסיפיקאַטי זענען מער מסתּמא צו האַלטן הויך עפעקטיווקייַט איבער אַ ברייט דינאַמיש קייט, ווייַל די אַסיי טוט נישט פּראָדוצירן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן, דערמיט קאַמפּיטינג מיט פּקר רייידזשאַנץ אָדער ינכיבאַט די הויפּט אַמפּלאַפאַקיישאַן אָפּרוף.

פון קורס, אין עטלעכע פאלן, ספּעציפֿישקייט איז נישט די מערסט וויכטיק, פֿאַר בייַשפּיל, ווען דער ציל איז צו קוואַנטיפיצירן ענג פֿאַרבונדענע אָבער פאַרשידענע פּאַטאַדזשאַנז, ספּעציעל פּלאַן, אַפּטאַמאַזיישאַן און וועראַפאַקיישאַן סטאַנדאַרדס זענען פארלאנגט.

די מעלטינג ויסבייג איז אַ נאָרמאַל אופֿן פֿאַר אַססעססינג די ספּעציפֿישקייט פון אַמפּליקאָנס, אין מינדסטער אין טערמינען פון צי צו פאַרגרעסערן אַ איין ציל.אָבער, עס מוזן זיין אונטערגעשטראכן אַז די מעלטינג קורוועס קענען זיין מיסלידינג ווייַל, למשל, זיי קענען זיין אַפעקטאַד דורך די קאַמביינד יפעקץ פון סובאָפּטימאַל אָנפאַנגער און נידעריק מוסטער קאַנסאַנטריישאַנז.

P5 |די מעלטינג ויסבייג ווייזט די Tm שיפץ באקומען פון צוויי דיטעקשאַנז פון פאַרשידענע אַמאַונץ פון צוויי ציל דנאַ.

יי אין העכער קאַנסאַנטריישאַנז (אַד)), עס איז קיין קלאָר ווי דער טאָג אָנפאַנגער דימער נאָך די qPCR מעזשערמאַנט איז געענדיקט.ווי די מוסטער קאַנסאַנטריישאַן דיקריסאַז צו 50 עקזעמפלארן (E), אַ ניט-ספּעציפיש פּראָדוקט הייבט צו דערשייַנען און ווערט דער בלויז פּראָדוקט מיט די לאָואַסט קאַנסאַנטריישאַן (ו).

בי די פּראָבע רעקאָרדעד די זעלבע טמס אין אַלע ציל קאַנסאַנטריישאַנז, און עס איז קיין קלאָר ווי דער טאָג אָנפאַנגער דימער אפילו אין די לאָואַסט קאַנסאַנטריישאַן (5 קאפיעס).ווען ניצן די צוויי דיטעקשאַן מעטהאָדס, קיין אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן זענען דיטעקטאַד אין NTCs.

P5 ווייזט די דיסאַלושאַן קורוועס באקומען מיט סאַמפּאַלז אין וואָס די מוסטער איז פאָרשטעלן אין פאַרשידענע קאַנסאַנטריישאַנז.פּ 5 אַ ווייזט אַז ביי די צוויי לאָואַסט קאַנסאַנטריישאַנז, די טמס פון די געשאפן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן זענען נידעריקער ווי אַז פון די ספּעציפיש אַמפּליקאַנז.

דאָך, דעם דיטעקשאַן אופֿן קענען ניט זיין רילייאַבלי געניצט צו דעטעקט טאַרגאַץ וואָס עקסיסטירן אין נידעריק קאַנסאַנטריישאַנז.

ינטערעסטינגלי, NTCs, ד"ה סאַמפּאַלז מיט קיין דנאַ אין אַלע, האט נישט רעקאָרדירן (ניט-ספּעציפיש) אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן, וואָס ינדיקייץ אַז הינטערגרונט גענאָמיק דנאַ קענען אָנטייל נעמען אין ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן / פּאַלימעראַזיישאַן.

מאל אַזאַ הינטערגרונט אָנפאַנגער און ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן קענען ניט זיין רימאַדיד, אָבער עס איז אָפט מעגלעך צו פּלאַן אַ דיטעקשאַן אופֿן וואָס טוט נישט האָבן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן אין קיין מוסטער קאַנסאַנטריישאַן און NTC (P 5b).

דאָ, אפילו רעקאָרדינג די אַמפּלאַפאַקיישאַן פון די ציל קאַנסאַנטריישאַן מיט אַ Cq פון 35 וועט פּראָדוצירן אַ ספּעציפיש דיסאַלושאַן ויסבייג.סימילאַרלי, NTCs געוויזן קיין וואונדער פון ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.מאל, די דיטעקשאַן נאַטור קען זיין אָפענגיק אויף די מוטער מאַשקע, און בלויז ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן איז דיטעקטאַד אין זיכער באַפער קאַמפּאַזישאַנז, וואָס קען זיין שייַכות צו פאַרשידענע Mg2+ קאַנסאַנטריישאַנז.

פעסטקייַט פון דיטעקשאַן

די אַפּטאַמאַזיישאַן פון טאַ איז אַ נוציק שריט אין די עמפּיריקאַל וועראַפאַקיישאַן און אַפּטאַמאַזיישאַן פּראָצעס פון qPCR דיטעקשאַן.עס גיט אַ דירעקט אָנווייַז פון די ראָובאַסטנאַס פון די אָנפאַנגער שטעלן דורך ווייַזן די טעמפּעראַטור (אָדער טעמפּעראַטור קייט) וואָס טראגט די לאָואַסט Cq אָן אַמפּלאַפייינג די NTC.

די צוויי צו פיר-פאַרלייגן חילוק אין סענסיטיוויטי קען נישט זיין וויכטיק פֿאַר מענטשן מיט הויך מרנאַ אויסדרוק, אָבער פֿאַר דיאַגנאָסטיק טעסץ, דאָס קען מיינען די חילוק צווישן positive און פאַלש נעגאַטיוו רעזולטאַטן.

די טאַ פּראָפּערטיעס פון qPCR פּרימערז קען זיין זייער אַנדערש.עטלעכע טעסץ זענען נישט זייער שטאַרק, און אויב זיי זענען נישט דורכגעקאָכט אונטער די אָפּטימאַל טאַ ווערט פון די פּרימערז, זיי וועלן געשווינד ייַנבראָך.

דאָס איז וויכטיק ווייַל דעם טיפּ פון דיטעקשאַן איז אָפט פּראָבלעמאַטיק אין דער עמעס וועלט, און די ריינקייַט פון די מוסטער, די קאַנסאַנטריישאַן פון דנאַ אָדער די בייַזייַן פון אנדערע דנאַ קען נישט זיין אָפּטימאַל.

אין אַדישאַן, די ציל קאָפּיע נומער קען בייַטן אין אַ ברייט קייט, און די רייידזשאַנץ, פּלאַסטיק יוטענסאַלז אָדער ינסטראַמאַנץ קען זיין אַנדערש פון די געניצט ווען איר שטעלן די פּראָבע.

P6|דער טעמפּעראַטור גראַדיענט ווייזט די פאַרשידענע שטאַרקייט פון פּקר דיטעקשאַן.

A. ניצן Bioline's Sensifast SYBR מאַסטערמיקס (קאַטעגאָריע נומער BIO-98050) צו דורכפירן פּקר אויף קדנאַ צוגעגרייט פון מענטשלעך מאַרך רנאַ.

B. ניצן Bio-Rad's CFX qPCR קיילע צו רעקאָרדירן די אַמפּלאַפאַקיישאַן מאַפּע און דיסאַלושאַן ויסבייג פון אַפּאַלענע (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. אַמפּלאַפאַקיישאַן גראַפיק און מעלטינג ויסבייג פון ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

די אַמפּלאַפאַקיישאַן גראַפיק און דיסאַלושאַן ויסבייג פון GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs רעקאָרדעד אין פאַרשידענע אַנילינג טעמפּעראַטורעס, ווייַזונג די חילוק אין Cq רעקאָרדעד אונטער אַ 7C טעמפּעראַטור גראַדיענט.

פּ 6 ווייזט אַ טיפּיש רעזולטאַט פון אַ אַנדיזייראַבאַל פּראָבע, ווו qPCR איז דורכגעקאָכט מיט אַ גראַדיענט טאַס צווישן 59C און 67C (P6a), ניצן אָנפאַנגער פֿאַר דריי מענטש מאַרך-ספּעציפיש גענעס.

עס קענען זיין געזען פֿון די אַמפּלאַפאַקיישאַן גראַפיק אַז אָפּאַלין אָנפאַנגערס זענען ווייט פון ידעאַל ווייַל זייער אָפּטימאַל טאַ קייט איז זייער שמאָל (פיגורע 6ב), דאָס הייסט, Cqs זענען וויידלי דיספּערסט, ריזאַלטינג אין Cqs איז באטייטיק קאַמפּערד מיט זייער אָפּטימאַל Cqs נידעריק.

דער דיטעקשאַן אופֿן איז אַנסטייבאַל און קען פירן צו סובאָפּטימאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן.דעריבער, דעם פּאָר פון פּרימערז זאָל זיין רידיזיינד.אין דערצו, די מעלטינג ויסבייג אַנאַליסיס (ינסעט) ווייזט אַז די ספּעציפֿישקייט פון דעם דיטעקשאַן אופֿן קען אויך זיין פּראָבלעמאַטיק, ווייַל די מעלטינג ויסבייג פון יעדער טאַ איז אַנדערש.

די ACSBG1 דיטעקשאַן אופֿן געוויזן אין P 6c איז מער געזונט ווי די אָפּאַלין דיטעקשאַן אופֿן אויבן, אָבער עס איז נאָך ווייַט פון ידעאַל, און עס איז מסתּמא אַז עס קענען זיין ימפּרוווד.

אָבער, מיר ונטערשטרייַכן אַז עס איז קיין נייטיק קשר צווישן ראָובאַסטנאַס און ספּעציפֿישקייט, ווייַל די דיסאַלושאַן ויסבייג געשאפן דורך דעם דיטעקשאַן אופֿן ווייזט די זעלבע שפּיץ ווערט אין אַלע טאַס (ינסעט).

אויף די אנדערע האַנט, די ראָובאַסטנאַס פּרובירן איז פיל מער טאָלעראַנט, פּראַדוסינג ענלעך קקס אין אַ ברייט קייט פון טאַס, ווי אין די GFAP פּראָבע געוויזן אין P 6d.

דער חילוק אין Cqs באקומען אין דער זעלביקער קייט פון 8 דיגריז סעלסיוס איז ווייניקער ווי 1, און די דיסאַלושאַן ויסבייג (ינסעט) קאַנפערמז די דיטעקשאַן קעראַקטעריסטיקס אין דעם טעמפּעראַטור קייט.עס איז כדאי צו באמערקן אַז די קאַלקיאַלייטיד טאַס און די פאַקטיש טאַ קייט קען זיין זייער אַנדערש.

עס זענען פילע גיידליינז דיזיינד צו העלפן ריסערטשערז פּלאַן עפעקטיוו פּרימערז, רובֿ פון וואָס זענען באזירט אויף לאַנג-געגרינדעט כּללים און אַ פּלאַץ פון ופמערקזאַמקייט איז באַצאָלט צו די 3′ סוף פון די אָנפאַנגער.עס איז אָפט רעקאַמענדיד צו אַרייַננעמען אַ G אָדער C אין די 3' סוף און צוויי G אָדער C באַסעס (GC קלאַמערן), אָבער ניט מער ווי צוויי פון די לעצטע 5 באַסעס.

אין פיר, די כּללים קענען פירן ריסערטשערז, אָבער זיי זענען נישט דאַווקע ריכטיק אונטער אַלע צושטאנדן.

P7 |די 3′ סוף פון די אָנפאַנגער האט אַ קליין ווירקונג אויף ספּעסיפיסיטי אָדער עפעקטיווקייַט.

יי די שטעלע פון ​​די פּרימערז פֿאַר די מענטשלעך HIF-1α (NM_181054.2) דזשין.

ב. ניצן Agilent Brilliant III SYBR גרין מוטער מאַשקע (קאַט. נומ. 600882) צו פאַרגרעסערן זעקס פּרובירן זאכן.

C. אַמפּלאַפאַקיישאַן גראַפיק און מעלטינג ויסבייג רעקאָרדעד דורך Bio-Rad's CFX qPCR קיילע און 3′ענד אָנפאַנגער.NTCs זענען געוויזן אין רויט.

D. Cqs רעקאָרד פון יעדער פּרובירן נומער

פֿאַר בייַשפּיל, דער רעזולטאַט אין פּ 7 קאַנטראַדיקץ די 3′ סוף הערשן.אַלע דיזיינז פּראָדוצירן בייסיקלי די זעלבע רעזולטאַטן, מיט בלויז צוויי אָנפאַנגער קאַמבאַניישאַנז וואָס פירן צו ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן אין NTC.

אָבער, מיר קענען נישט שטיצן די ווירקונג פון די GC קלעמערל, ווייַל אין דעם פאַל, ניצן א אָדער ה ווי אַ מאַקסימום פון 30 באַסעס טוט נישט רעדוצירן די ספּעסיפיסיטי.

טעסט C, ווו די F אָנפאַנגער ענדס אין GGCC, האט רעקאָרדעד Cqs אין NTCs, ינדאַקייטינג אַז מען זאל וועלן צו ויסמיידן די סיקוואַנסיז אין די 30-סוף.מיר ונטערשטרייַכן אַז דער בלויז וועג צו באַשטימען די בעסטער 3'ענד סיקוואַנס פון אַ אָנפאַנגער פּאָר איז צו אָפּשאַצן עטלעכע קאַנדידאַט אָנפאַנגערס יקספּערמענאַלי.

אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט

ימפּאָרטאַנטלי, כאָטש ניט-ספּעציפיש פּקר דיטעקשאַן קענען קיינמאָל ווערן ספּעציפיש, די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט קענען זיין אַדזשאַסטיד און מאַקסאַמייזד אין פילע פאַרשידענע וועגן דורך טשאַנגינג די ענזיים, מוטער מאַשקע, אַדאַטיווז און סייקלינג טנאָים.

צו אָפּשאַצן די עפעקטיווקייַט פון פּקר דיטעקשאַן, עס איז בעסטער צו נוצן אַ סיריאַל דיילושאַן פון 10 אָדער 5 מאל די ציל נוקלעיק זויער, דאָס איז די "נאָרמאַל ויסבייג אופֿן".

אויב פּקר אַמפּליקאָנס אָדער סינטעטיש דנאַ טאַרגאַץ זענען געניצט צו דזשענערייט אַ נאָרמאַל ויסבייג, סיריאַל דילושאַנז פון די טאַרגאַץ זאָל זיין געמישט מיט אַ קעסיידערדיק סומע פון ​​הינטערגרונט דנאַ (אַזאַ ווי גענאָמיק דנאַ).

P8 |דילוטיאָן ויסבייג צו אָפּשאַצן די עפעקטיווקייַט פון PCR.

A. ניצן אָנפאַנגער פֿאַר HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA און R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC און Agilent's Brilliant III SYBR גרין מאַסטערמיקס (קאַטאַליק נומער 600882) פֿאַר פּקר און מעלטינג ויסבייג טנאָים.

בי 100 נג רנאַ איז געווען פאַרקערט טראַנסקריבעד, דיילוטאַד 2 מאל, און סיריאַל דיילוטאַד קדנאַ סאַמפּאַלז זענען דיילוטאַד 5 מאל צו 1 נג מענטש גענאָמיק דנאַ.די מעלטינג ויסבייג איז געוויזן אין די ינסעט.

C. די RT אָפּרוף, דיילושאַן און סיריאַל דיילושאַן זענען ריפּיטיד פֿאַר די רגע cDNA מוסטער, און די רעזולטאַטן זענען ענלעך.

פּ 8 ווייזט צוויי נאָרמאַל קורוועס, מיט די זעלבע דיטעקשאַן אופֿן אויף צוויי פאַרשידענע קדנאַ סאַמפּאַלז, דער רעזולטאַט איז די זעלבע עפעקטיווקייַט, וועגן 100%, און די R2 ווערט איז אויך ענלעך, דאָס איז, די גראַד פון פּאַסיק צווישן די יקספּערמענאַל דאַטן און די ראַגרעשאַן שורה אָדער די לינעאַריטי פון דאַטן.

די צוויי נאָרמאַל קורוועס זענען פאַרגלייַכלעך, אָבער נישט פּונקט די זעלבע.אויב דער ציל איז צו אַקיעראַטלי קוואַנטיפיצירן דעם ציל, עס מוזן זיין באמערקט אַז עס איז אַנאַקסעפּטאַבאַל צו צושטעלן אַ קאָפּיע נומער כעזשבן אָן דערקלערן די אַנסערטאַנטי

P9 |מעאַסורעמענט אַנסערטאַנטי פֿאַרבונדן מיט קוואַנטיפיקאַטיאָן ניצן אַ נאָרמאַל ויסבייג.

A. ניצן אָנפאַנגער פֿאַר GAPDH (NM_002046) צו דורכפירן פּקר און מעלטינג ויסבייג טנאָים.F: ACAGTTGCCATGTAGACC און R: TAACTGGTTGAGCACAGG און Bioline's Sensifast SYBR מאַסטערמיקס (קאַטאַלאָג נומער BIO-98050).

בי אַמפּלאַפאַקיישאַן טשאַרט, מעלטינג ויסבייג און נאָרמאַל ויסבייג רעקאָרדעד מיט Bio-Rad's CFX qPCR קיילע.

C. נאָרמאַל ויסבייג גראַפיק און 95% בטחון מעהאַלעך (סי).

ד. די קאָפּיע נומער און 95% בטחון מעהאַלעך פון די דריי Cq וואַלועס דערייווד פון די דיילושאַן ויסבייג.

פּ 9 ווייזט אַז פֿאַר אַ אָפּטימיזעד פּראָבע, די טאָכיק וועריאַביליטי פון אַ איין נאָרמאַל ויסבייג איז בעערעך 2 מאל (95% בטחון מעהאַלעך, מינימום צו מאַקסימום), וואָס קען זיין דער קלענסטער וועריאַביליטי וואָס קענען זיין דערוואַרט.

פֿאַרבונדענע פּראָדוקט:

צעל דירעקט רט קפּקר קיט

מויז טייל דירעקט פּקר קיט

אַנימאַל געוועב דירעקט פּקר קיט