טראַדיציאָנעל פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסאַז קענען נישט דערלאָזן הויך טעמפּעראַטורעס (די אָפּטימאַל טעמפּעראַטור פֿאַר MMLV טעטיקייט איז 37-50 ° C, און AMV איז 42-60 ° C).די מער קאָמפּליצירט וויראַל רנאַ קענען ניט זיין יפעקטיוולי פאַרקערט טראַנסקריבעד אין קדנאַ ביי נידעריק טעמפּעראַטורעס, ריזאַלטינג אין דיטעקשאַן עפעקטיווקייַט די רעדוקציע.טראַדיציאָנעל RT-qPCR בכלל ריקווייערז די אָנטייל פון צוויי שליסל ענזימעס (פאַרקערט טראַנסקריפּציע און דנאַ פּאָלימעראַסע), וואָס מאכט עס אוממעגלעך צו פאַרפּאָשעטערן די אָפּעראַציע פון ​​די אָפּרוף סיסטעם און רעדוצירן די פּרייַז.דאָ מיר וועלן פאָרשטעלן צוויי הויך-טעמפּעראַטור-קעגנשטעליק פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסאַז, TtH און RevTaq.די צוויי ענזימעס אויך האָבן די פֿונקציע פון ​​דנאַ פּאָלימעראַסע, אַזוי זיי זענען גערופן בייפונקטיאָנאַל ענזימעס.

טטה דנאַ פּאָלימעראַסע

איר מוזן האָבן געהערט וועגן TtH, וואָס איז דערייווד פון די טערמאָפיליק באַקטיריאַ Thermus thermophilus HB8.אין דעם בייַזייַן פון דייוואַלאַנט קיישאַנז אַזאַ ווי Mg2+, עס האט דנאַ פּאָלימעראַסע טעטיקייט.עס איז וויידלי געניצט אין פּקר ריאַקשאַנז ווי טאַק ענזיים, אָבער עס האט העכער היץ קעגנשטעל ווי טאַק ענזיים, אַזוי עס אויך האט אַ בעסער ווירקונג אויף פּקר מיט טעמפּלאַטעס מיט הויך גק אינהאַלט.

· דעם ענזיים בייסיקלי האט קיין 3′→5′ עקסאָנוקלאַסע טעטיקייט און 5′→3′ עקסאָנוקלעאַס טעטיקייט, אַזוי עס קענען אויך זיין געניצט פֿאַר דידעאָקסי סיקוואַנסינג.

· דעם ענזיים האט RTase טעטיקייט.אין דעם בייַזייַן פון Mn2+, RTase טעטיקייט וועט זיין ימפּרוווד.ניצן דעם שטריך, עס קענען זיין געוויינט צו דורכפירן פאַרקערט טראַנסקריפּציע אָפּרוף און פּקר אָפּרוף אין דער זעלביקער רער, דאָס איז, איין-שריט RT-PCR.אָבער, אין דעם בייַזייַן פון Mn2 +, די אַקיעראַסי פון RT-PCR איז נישט הויך.רט טעטיקייט האט גאָרנישט צו טאָן מיט רנאַאַסע ה טעטיקייט.

· די געוואקסן טעטיקייט פון טטה-דנאַ פּאָלימעראַסע (פּH9, אָפּטימום +55℃～+70℃, מאַקסימום +95℃) מנצח די פּראָבלעמס געפֿירט דורך רנאַ צווייטיק סטרוקטור.די ריזאַלטינג cDNA קענען זיין אַמפּלאַפייד דורך פּקר מיט דער זעלביקער ענזיים אין דעם בייַזייַן פון Mg2+ ייאַנז.

· די פיייקייט פון Tth-DNA פּאָלימעראַסע צו דורכפירן פאַרקערט טראַנסקריפּציע און דנאַ אַמפּלאַפאַקיישאַן ביי הויך טעמפּעראַטורעס מאכט דעם ענזיים נוציק פֿאַר קוואַנטיטאַטיווע RT-PCR, קלאָונינג און דזשין אויסדרוק אַנאַליסיס פון סעליאַלער און וויראַל רנאַ.
· טטה-דנאַ פּאָלימעראַסע איז געניצט פֿאַר רט-פּקר צו אַמפּלאַפיי רנאַ אַרויף צו 1קב.

פֿעיִקייטן און אַדוואַנטידזשיז

טטה דנאַ פּאָלימעראַסע:

• פאַרזיכערן די אָפּטימיזעד פּאָלימעראַסע קייט רעאַקציע (PCR) פּראָדוקט גרייס, בייַ מינדסטער 1000 בפּ אין די RT-PCR אָפּרוף

• אָננעמען מאַדאַפייד דעאָקסיריבאָנוקלעאָסידע טריפאָספאַטע ווי אַ סאַבסטרייט

• ניט שייַכות צו RNase H טעטיקייט

• האט הויך טערמאַל פעסטקייַט צו באַקומען פּראָבלעמס, יוזשאַוואַלי שייַכות צו די הויך צווייטיק סטרוקטור פאָרשטעלן אין רנאַ

RevTaq RT-PCR דנאַ פּאָלימעראַסע

א היץ-קעגנשטעליק דנאַ פּאָלימעראַסע מיט פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע טעטיקייט

RevTaq-RT-PCR-DNA פּאָלימעראַסע איז אַן ענדזשאַנירד, העכסט היץ-קעגנשטעליק, צווייענדיק-פאַנגקשאַנאַל ענזיים מיט פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע און דנאַ פּאָלימעראַסע אַקטיוויטעטן באקומען דורך דירעקטעד און קינסטלעך עוואָלוציע.

· די האַלב-לעבן פון RevTaq RT-PCR דנאַ פּאָלימעראַסע ביי 95 ° C איז מער ווי 40 מינוט.

· RevTaq RT-PCR דנאַ פּאָלימעראַסע אַלאַוז הויך-טעמפּעראַטור פאַרקערט טראַנסקריפּציע גלייַך פֿון די רנאַ מוסטער, און די פאַרקערט טראַנסקריפּציע שריט קענען זיין ריפּיטיד עטלעכע מאָל צו דזשענערייט מער קדנאַ טעמפּלאַטעס.

· RevTaq RT-PCR דנאַ פּאָלימעראַסע אַלאַוז "נול-שריט" RT-PCR (קיין יסאָטהערמאַל פאַרקערט טראַנסקריפּציע שריט), ווייַל אין די סייקליק פּקר פאַרלענגערונג שריט, פאַרקערט טראַנסקריפּציע און דנאַ אַמפּלאַפאַקיישאַן פאַלן סיימאַלטייניאַסלי.דאָס אויך פּראַמאָוץ די פאַרקערט טראַנסקריפּציע אָפּרוף ביי הויך טעמפּעראַטורעס, דערמיט מינאַמייזינג די פראבלעמען וואָס זענען געפּלאָנטערט אין מעלטינג די שטאַרק צווייטיק סטרוקטור אין רנאַ ביי הויך טעמפּעראַטורעס.

· רעכט צו דער אַפּטאַמער-באזירט הייס-אָנהייב פאָרמולע, RevTaq RT-PCR דנאַ פּאָלימעראַסע וועט פּראָדוצירן בעסער רעזולטאַטן ווען די אַנילינג און פאַרלענגערונג טעמפּעראַטור איז העכער ווי 57 °C.

· זינט די ענזיים איז היץ-קעגנשטעליק, עס איז רעקאַמענדיד צו פּלאַן אָנפאַנגער און פּראָבעס מיט זייער הויך מעלטינג פונקטן (> 60 ° C).

· עס איז רעקאַמענדיד צו אַפּטאַמייז די טעמפּעראַטור פון די אַנילינג / פאַרלענגערונג שריט דורך אַ טעמפּעראַטור גראַדיענט בעשאַס די אָפּרוף סעטאַפּ פּראָצעס.

· די העכער די טעמפּעראַטור, די העכער די ספּעסיפיסיטי פון פּקר.דער פאַרקערט טראַנסקריפּציע ציקל איז יוזשאַוואַלי דורכגעקאָכט אין אַ העכער טעמפּעראַטור ווי די פּקר ציקל, ווייַל דנאַ אָנפאַנגער: רנאַ מוסטער כייברידיזיישאַן יוזשאַוואַלי האט אַ העכער מעלטינג פונט ווי דנאַ אָנפאַנגער: קדנאַ מוסטער דופּלעקס.

· RevTaq RT-PCR דנאַ פּאָלימעראַסע איז דזשאַנעטיקלי ענדזשאַנירד און אָפּטימיזעד, און די אַמפּליקאָן גרייס איז צווישן 60-300 בפּ.

RevTaq RT-PCR דנאַ פּאָלימעראַסע דיטעקשאַן שיעור ריטשאַז 4 עקזעמפלארן /

די אָפּטימיזעד אָפּרוף סיסטעם (די פאַרלייגן פון הויך מעלטינג פונט פּרימערז) איז געוויזן אין די פיגור.RevTaq RT-PCR דנאַ פּאָלימעראַסע-געטריבן RT-PCR ווייזט בעסער סענסיטיוויטי ווי TaqPath 1-שריט RT-qPCR בעל מישן, און נידעריקער דיטעקשאַן מוסטער דיילושאַן גראַדיענט.

מער אַדוואַנטידזשיז:

שנעל אָנהייב פֿונקציע → דער ערשט טערמאַל דענאַטוראַטיאָן שריט קענען זיין סקיפּט.

הייס-אָנהייב אַפּטאַמער פאָרמולע → צושטעלן 100% ענזיים טעטיקייט מיד און פאַרמייַדן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן ביי נידעריק טעמפּעראַטורעס (<57 ° C).

קלעאַוואַגע פֿונקציע → די רנאַ יקסטראַקשאַן שריט איז איבערגעהיפּערט, ווייַל RevTaq RT-PCR דנאַ פּאָלימעראַסע קענען אויך פּראָצעס גראָב אָפּרוף סאַמפּאַלז.עס קענען מיד צעשטערן די צעל מעמבריינז פון עוקאַריאָטעס, באַקטיריאַ און ווירוסעס אין אַ הייס רט-פּקר ציקל.

IVD רוי מאַטעריאַל מדרגה → הויך קוואַליטעט סטאַנדאַרדס און גאָר קאַמפּעטיטיוו פּרייסאַז