Ⅰ. פאַרגרעסערן די סענסיטיוויטי פון די אָפּרוף סיסטעם:
1. באַזונדער הויך-קוואַליטעט רנאַ:
געראָטן cDNA סינטעז קומט פון הויך-קוואַליטעט רנאַ.הויך-קוואַליטעט רנאַ זאָל ענשור אין מינדסטער אַ גאַנץ מער און טוט נישט אַנטהאַלטן ינכיבאַטערז וואָס טאָן ניט אַנטהאַלטן רעקאָרדינג ענזימעס, אַזאַ ווי עדטאַ אָדער סדס.די קוואַליטעט פון רנאַ דיטערמאַנז די מאַקסימום ווערט פון די סיקוואַנס אינפֿאָרמאַציע איר קענען טראַנסקריבירן צו די cDNA.דער גענעראַל רנאַ רייניקונג אופֿן איז אַ שריט אופֿן פון ניצן יסאָאָסיאַנאַטע / אַסידאָפענאָל.אין סדר צו פאַרמייַדן די פאַרפּעסטיקונג פון רנאַסע, די רנאַ אפגעשיידט פון אַ מוסטער רייַך אין רנאַסע (אַזאַ ווי פּאַנקרעאַס) ריקווייערז סטאָרידזש פון פאָרמאַלדאַכייד צו ראַטעווען הויך-קוואַליטעט רנאַ, וואָס איז אפילו מער אַזוי פֿאַר לאַנג-טערמין סטאָרידזש.די רנאַ יקסטראַקטיד פון די שטשור לעבער איז בייסיקלי דיגריידיד נאָך איין וואָך פון סטאָרידזש אין וואַסער, בשעת די רנאַ יקסטראַקטיד פון די שטשור מילץ פארבליבן סטאַביל נאָך דריי יאָר פון סטאָרידזש אין וואַסער.אין אַדישאַן, טראַנסקריפּץ גרעסער ווי 4 קב זענען מער שפּירעוודיק צו שפּור רנאַסע דערנידעריקונג ווי קליין טראַנסקריפּץ.אין סדר צו פאַרגרעסערן די פעסטקייַט פון די סטאָרידזש רנאַ מוסטער, די רנאַ קענען זיין צעלאָזן אין אַ מעטאַלמאַמין פון יאָן און איז סטאָרד -70 °C.טהילידע געניצט צו ראַטעווען רנאַ מוזן נישט אַנטהאַלטן אַ פאַרשיידן כייפעץ וואָס דיגרייד רנאַ.רנאַ, וואָס איז דערייווד פון פּאַנקרעאַס, קענען זיין געראטעוועט אין מעטאַלמאַמינע פֿאַר בייַ מינדסטער איין יאָר.ווען איר זענט גרייט צו נוצן רנאַ, איר קענען נוצן די פאלגענדע מעטהאָדס צו אָפּזעצן רנאַ: לייגן NaCl צו 0.2 ם און 4 מאל די באַנד פון עטאַנאָל, שטעלן צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 3-5 מינוט, און 10,000 × ג סענטריפוגאַל פֿאַר 5 מינוט.
2. ניצן פאַרקערט טראַנסקריפּציע אָן RNaseH טעטיקייט (RNaseH-):
רנאַסע ינכיבאַטערז זענען אָפט מוסיף צו פאַרקערט טראַנסקריפּציע ריאַקשאַנז צו פאַרגרעסערן די לענג און טראָגן פון cDNA סינטעז.רנאַסע ינכיבאַטער איז מוסיף אין דער ערשטער קייט סינטעז אָפּרוף אין דעם בייַזייַן פון באַפערז און רידוסינג אגענטן אַזאַ ווי DTT ווייַל די פאַר-קדנאַ סינטעז פּראָצעס דענאַטשערז די ינכיבאַטער, דערמיט ריליסינג געבונדן רנאַסעס וואָס דיגרייד רנאַ.פּראָטעין רנאַסע ינכיבאַטער בלויז פּריווענץ די דערנידעריקונג פון רנאַ דורך רנאַסע א, ב, C, און טאָן ניט פאַרמייַדן רנאַסעס אויף די הויט, אַזוי איר זאָל זיין אָפּגעהיט ניט צו באַקענען רנאַסעס פון די פינגער טראָץ די נוצן פון די ינכיבאַטערז.
פאַרקערט טראַנסקריפּציע קאַטאַליזיז די קאַנווערזשאַן פון רנאַ אין cDNA.ביידע M-MLV און AMV האָבן ענדאָגענאָוס RNaseH טעטיקייט אין אַדישאַן צו זייער אייגענע פּאָלימעראַסע טעטיקייט.רנאַסעה טעטיקייט קאַמפּיץ מיט פּאָלימעראַסע טעטיקייט פֿאַר העטעראָזיגאָוס סטראַנדז געשאפן צווישן רנאַ טעמפּלאַטעס און דנאַ פּרימערז אָדער קדנאַ געשפּרייט סטראַנדז, און דיגרייד רנאַ: רנאַ סטראַנדז אין דנאַ קאַמפּלעקסאַז.רנאַ טעמפּלאַטעס דיגריידיד דורך RNaseH טעטיקייט קענען ניט מער זיין געוויינט ווי עפעקטיוו סאַבסטרייץ פֿאַר cDNA סינטעז, רידוסינג די טראָגן און לענג פון cDNA סינטעז.אַזוי ילימאַנייטינג אָדער זייער רידוסינג RNaseH טעטיקייט פון פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע וואָלט זיין פון גרויס נוץ.
SuperScriptⅡ פאַרקערט טראַנסקריפּציע, MMLV פאַרקערט טראַנסקריפּציע פון RNaseH- און טערמאָסקריפּט פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע, AMV פון RNaseH- יילדאַד מער פול-לענג קדנאַ ווי MMLV און AMV.RT-PCR סענסיטיוויטי איז אַפעקטאַד דורך די סומע פון קדנאַ סינטאַסייזד.ThermoScript איז פיל מער שפּירעוודיק ווי AMV.די גרייס פון RT-PCR פּראָדוקטן איז לימיטעד דורך די פיייקייט פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע צו סינטאַסייז קדנאַ, ספּעציעל ווען קלאָונינג גרעסערע קדנאַ.קאַמפּערד מיט MMLV, SuperScripⅡ באטייטיק געוואקסן די טראָגן פון לאַנג RT-PCR פּראָדוקטן.די פאַרקערט טראַנסקריפּציע פון RNaseH- אויך ינקריסאַז טערמאַל פעסטקייַט, אַזוי דער אָפּרוף קענען זיין דורכגעקאָכט ביי טעמפּעראַטורעס העכער ווי נאָרמאַל פון 37-42 ℃.אונטער די סאַגדזשעסטיד סינטעז טנאָים, אָליגאָ (דט) פּרימערז און 10μCi [alpha-p]dCTP זענען געניצט.די גאַנץ פּראָדוקציע פון דער ערשטער קייט איז קאַלקיאַלייטיד מיט די טקאַ אָפּזאַץ אופֿן.פול-לענג cDNA איז אַנאַלייזד מיט גרייס-סאָרטיד פּאַס באַזייַטיקונג און קאַונטינג אין אַ אַלקאַליין אַגאַראָסע געל.
3. פאַרגרעסערן די היץ פּרעזערוויישאַן טעמפּעראַטור פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע:
העכער האלטן טעמפּעראַטור העלפט צו עפֿענען די צווייטיק סטרוקטור פון רנאַ און פאַרגרעסערן די טראָגן פון דער אָפּרוף.פֿאַר רובֿ רנאַ טעמפּלאַטעס, האלטן די רנאַ און אָנפאַנגער בייַ 65 ° C אָן באַפער אָדער זאַלץ און דעמאָלט קאָאָלינג זיי געשווינד אויף אייז ילימאַנייץ רובֿ צווייטיק סטראַקטשערז און אַלאַוז די אָנפאַנגער צו בינדן.אָבער, עטלעכע טעמפּלאַטעס נאָך האָבן צווייטיק סטרוקטור, אַפֿילו נאָך טערמאַל דענאַטוראַטיאָן.אַמפּלאַפאַקיישאַן פון די שווער טעמפּלאַטעס קענען זיין דורכגעקאָכט מיט ThermoScript פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע און דורך פּלייסינג די פאַרקערט טראַנסקריפּציע אָפּרוף ביי העכער טעמפּעראַטורעס צו פֿאַרבעסערן אַמפּלאַפאַקיישאַן.העכער האלטן טעמפּעראַטורעס קענען אויך פאַרגרעסערן ספּעסיפיקאַטי, ספּעציעל ווען cDNA סינטעז איז דורכגעקאָכט מיט דזשין-ספּעציפיש פּרימערז (GSPS) (זען טשאַפּטער 3).אויב איר נוצן GSP, מאַכן זיכער אַז די Tm ווערט פון די אָנפאַנגער איז די זעלבע ווי די דערוואַרט האלטן טעמפּעראַטור.דו זאלסט נישט נוצן אָליגאָ (דט) און ראַנדאָם פּרימערז העכער 60 ℃.ראַנדאָם פּרימערז דאַרפֿן צו זיין געהאלטן בייַ 25 ℃ פֿאַר 10 מינוט איידער ינקריסינג צו 60 ℃.אין אַדישאַן צו נוצן העכער פאַרקערט טראַנסקריפּציע טעמפּעראַטורעס, ספּעסיפיקייט קענען זיין ימפּרוווד דורך גלייַך טראַנספערינג די רנאַ / אָנפאַנגער געמיש פון די 65 ℃ דענאַטורינג טעמפּעראַטור צו די פאַרקערט טראַנסקריפּציע האלטן טעמפּעראַטור און אַדינג אַ פּרעהעאַטעד 2 × אָפּרוף געמיש (cDNA טערמאַל ינישיישאַן סינטעז).דעם צוגאַנג העלפט פאַרמייַדן די ינטערמאָלעקולאַר באַזע פּערינג וואָס אַקערז ביי נידעריקער טעמפּעראַטורעס.ניצן אַ פּקר קיילע סימפּלאַפייז די פילע טעמפּעראַטור סוויטשיז פארלאנגט פֿאַר RT-PCR.
טטה היץ סטייבאַלייזד פּאָלימעראַסע אקטן ווי דנאַ פּאָלימעראַסע אין דעם בייַזייַן פון Mg2+ און רנאַ פּאָלימעראַסע אין דעם בייַזייַן פון Mn2+.עס קענען האַלטן היץ אַרויף צו 65 ℃.אָבער, די בייַזייַן פון Mn2+ בעשאַס פּקר ראַדוסאַז פאַדעלאַטי, וואָס מאכט טה פּאָלימעראַסע ווייניקער פּאַסיק פֿאַר הויך פּינטלעכקייַט אַמפּלאַפאַקיישאַן, אַזאַ ווי קדנאַ קלאָונינג.אין אַדישאַן, Tth איז ווייניקער עפעקטיוו אין פאַרקערט טראַנסקריפּציע, וואָס ראַדוסאַז סענסיטיוויטי, און זינט אַ איין ענזיים קענען דורכפירן פאַרקערט טראַנסקריפּציע און פּקר, קאָנטראָל ריאַקשאַנז אָן פאַרקערט טראַנסקריפּציע קענען ניט זיין געניצט צו ויסטיילן אַמפּלאַפייד פּראָדוקטן פון cDNA פון קאַנטאַמאַנייטאַד גענאָמיק דנאַ.
4. אַדאַטיוו וואָס פּראַמאָוץ פאַרקערט טראַנסקריפּציע:
די אַדישאַן פון אַדאַטיווז, אַרייַנגערעכנט גליסערין און דמסאָ, צו דער ערשטער קייט סינטעז אָפּרוף קענען רעדוצירן די פעסטקייַט פון די נוקלעיק זויער טאָפּל שנירל און אַנוויינד די צווייטיק סטרוקטור פון רנאַ.אַרויף צו 20% גליסערין אָדער 10% DMSO קענען זיין מוסיף אָן אַפעקטינג די טעטיקייט פון SuperScriptⅡ אָדער MMLV.AMV קענען אויך דערלאָזן אַרויף צו 20% גליסעראָל אָן רידוסינג טעטיקייט.צו מאַקסאַמייז די סענסיטיוויטי פון RT-PCR אין SuperScript Ⅱ פאַרקערט טראַנסקריפּציע אָפּרוף, 10% גליסעראָל קענען זיין מוסיף און ינסאַלייטיד ביי 45 ℃.אויב 1/10 פון די רעטראָטראַנסקריפּשאַן-רעאַקציע פּראָדוקט איז מוסיף צו די פּקר, די קאַנסאַנטריישאַן פון גליסעראָל אין די אַמפּלאַפאַקיישאַן אָפּרוף איז 0.4%, וואָס איז נישט גענוג צו ינכיבאַט פּקר.
5. RNaseH פּראַסעסינג:
סענסיטיוויטי קענען זיין ימפּרוווד דורך טרעאַטינג cDNA סינטעז ריאַקשאַנז מיט RNaseH איידער PCR.פֿאַר עטלעכע טעמפּלאַטעס, עס איז געדאַנק אַז די RNA אין די cDNA סינטעז אָפּרוף פּריווענץ די ביינדינג פון אַמפּלאַפייד פּראָדוקטן, אין וואָס פאַל די RNaseH באַהאַנדלונג קענען פאַרגרעסערן סענסיטיוויטי.אין אַלגעמיין, RNaseH באַהאַנדלונג איז פארלאנגט פֿאַר די אַמפּלאַפאַקיישאַן פון אַ לעפיערעך לאַנג פול-לענג קדנאַ ציל מוסטער, אַזאַ ווי טובעראָוס סטשעראָסיס Ⅱ מיט נידעריק קאָפּיע.פֿאַר דעם שווער מוסטער, RNaseH ענכאַנסט די סיגנאַל דזשענערייטאַד דורך די cDNA סינטאַסייזד דורך SuperScriptⅡ אָדער AMV.פֿאַר רובֿ RT-PCR ריאַקשאַנז, די RNaseH באַהאַנדלונג איז אַפּשאַנאַל ווייַל די 95 ℃ ינסאַלייטיד פּקר דינאַטוראַטיאָן שריט טיפּיקלי כיידראַלייזד די רנאַ פֿון די רנאַ: דנאַ קאָמפּלעקס.
6. ימפּרוווד מעטהאָדס פֿאַר דיטעקטינג קליין אַמאַונץ פון רנאַ:
RT-PCR איז דער הויפּט טשאַלאַנדזשינג ווען בלויז קליין אַמאַונץ פון רנאַ זענען בנימצא.די אַדישאַן פון גלייקאַדזשין ווי אַ טרעגער בעשאַס רנאַ צעשיידונג העלפּס צו פאַרגרעסערן די טראָגן פון קליין סאַמפּאַלז.אַ RNase-פֿרייַ גלייקאַדזשין קענען זיין מוסיף אין דער זעלביקער צייט ווי טריזאָל.גלייקאַדזשין איז וואַסער-סאַליאַבאַל און קענען בלייַבן אין די וואַסער פאַסע מיט רנאַ צו אַרוישעלפן אין סאַבסאַקוואַנט אָפּזאַץ.די רעקאַמענדיד קאַנסאַנטריישאַן פון רנאַסע-פריי גלייקאַדזשין איז 250 μג / מל פֿאַר סאַמפּאַלז ווייניקער ווי 50 מג פון געוועב אָדער 106 קאַלטשערד סעלז.
די אַדישאַן פון אַסעטילאַטעד BSA צו פאַרקערט טראַנסקריפּציע ריאַקשאַנז ניצן SuperScriptⅡ קענען פאַרגרעסערן די סענסיטיוויטי, און פֿאַר קליין אַמאַונץ פון רנאַ, רידוסינג די סומע פון SuperScriptⅡ און אַדינג 40 וניץ פון RnaseOut נוקלעאַסע ינכיבאַטער קענען פֿאַרבעסערן די דיטעקשאַן מדרגה.אויב גלייקאַדזשין איז געניצט אין רנאַ צעשיידונג, די אַדישאַן פון BSA אָדער רנאַסע ינכיבאַטערז צו פאַרקערט טראַנסקריפּציע ריאַקשאַנז ניצן SuperScriptⅡ איז נאָך רעקאַמענדיד.
Ⅱ. פאַרגרעסערן די ספּעציפֿישקייט פון RT-PCR
1. cNDA סינטעז:
דריי פאַרשידענע מעטהאָדס קענען ווערן גענוצט צו אָנהייבן ערשטער שנירל קדנאַ סינטעז, און די קאָרעוו ספּעציפֿישקייט פון יעדער אופֿן אַפעקץ די סומע און טיפּ פון קדנאַ סינטאַסייזד.
טראַפ אָנפאַנגער אופֿן איז דער קלענסטער ספּעציפיש פון די דריי מעטהאָדס.פּרימערז זענען אַנניילד אין קייפל זייטלעך איבער די טראַנסקריפּט צו פּראָדוצירן קורץ, פּאַרטיייש לענג cDNA.דער אופֿן איז אָפט געניצט צו קריגן 5′ וואָקזאַל סיקוואַנסיז און קדנאַ פֿון רנאַ טעמפּלאַטעס מיט צווייטיק סטראַקטשעראַל מקומות אָדער מיט טערמאַנייטינג זייטלעך וואָס פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע קענען נישט רעפּלאַקייט.צו באַקומען די לאָנגעסט cDNA, די פאַרהעלטעניש פון אָנפאַנגער צו רנאַ אין יעדער רנאַ מוסטער דאַרף זיין עמפּיריקלי באשלאסן.די ערשט קאַנסאַנטריישאַן פון ראַנדאָם פּרימערז ריינדזשאַז פון 50 צו 250נג פּער 20μל אָפּרוף סיסטעם.ווייַל די קדנאַ סינטאַסייזד פֿון גאַנץ רנאַ ניצן טראַפ - פּרימערז איז דער הויפּט ריבאָסאָמאַל רנאַ, פּאָלי (א) + רנאַ איז בכלל אויסגעקליבן ווי די מוסטער.
אָליגאָ (דט) ינישיישאַן איז מער ספּעציפיש ווי טראַפ - פּרימערז.עס כייברידיזיז מיט די פּאָלי (א) עק געפֿונען אין די 3′ סוף פון מרנאַ אין רובֿ עוקאַריאָטיק סעלז.ווייַל פּאָלי (א) + רנאַ איז בעערעך 1% צו 2% פון גאַנץ רנאַ, די סומע און קאַמפּלעקסיטי פון קדנאַ איז פיל ווייניקער ווי אויב ראַנדאָם פּרימערז זענען געניצט.ווייַל פון זייַן הויך ספּעסיפיקאַטי, אָליגאָ (דט) בכלל טוט נישט דאַרפן אַפּטאַמאַזיישאַן פֿאַר רנאַ צו אָנפאַנגער פאַרהעלטעניש און פּאָלי (א) + סעלעקציע.עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן 0.5μג אָליגאָ (דט) פּער 20μל אָפּרוף סיסטעם.oligo(dT)12-18 איז פּאַסיק פֿאַר רובֿ RT-PCR.ThermoScript RT-PCR סיסטעם גיט אָליגאָ (דט) 20 ווייַל פון זיין גוט טערמאַל פעסטקייַט און איז פּאַסיק פֿאַר העכער האלטן טעמפּעראַטורעס.
גענע-ספּעציפיש אָנפאַנגער (GSP) זענען די בעסטער ספּעציפיש אָנפאַנגער פֿאַר די פאַרקערט טראַנסקריפּציע שריט.GSP איז אַן אַנטיסענסע אָליגאָנוקלעאָסידע וואָס קענען ספּאַסיפיקלי כייברידיזירן מיט רנאַ דעסטיניישאַן סיקוואַנסיז, אלא ווי אַנאַלייז אַלע רנאַס ווי טראַפ פּרימערז אָדער אָליגאָ (דט).די כּללים געניצט צו פּלאַן פּקר אָנפאַנגערס אויך אַפּלייז צו די פּלאַן פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע אָפּרוף גספּ.GSP קענען זיין די זעלבע סיקוואַנס ווי די אַמפּלאַפאַקיישאַן אָנפאַנגער אַנניילד אין די סוף פון mRNA3′, אָדער GSP קענען זיין דיזיינד צו זיין אַנניילד דאַונסטרים מיט די פאַרקערט אַמפּלאַפאַקיישאַן אָנפאַנגער.פֿאַר עטלעכע אַמפּלאַפייד אַבדזשעקץ, עס איז נייטיק צו פּלאַן מער ווי איין אַנטיסענסע אָנפאַנגער פֿאַר מצליח RT-PCR ווייַל די צווייטיק סטרוקטור פון די ציל רנאַ קען פאַרמייַדן די אָנפאַנגער פון ביינדינג.עס איז סאַגדזשעסטיד צו נוצן 1 פּמאָל אַנטיסענסע גספּ אין דער ערשטער קייט סינטעז אָפּרוף סיסטעם פון 20μל.
2. פאַרגרעסערן די היץ פּרעזערוויישאַן טעמפּעראַטור פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע:
אין סדר צו נוצן די GSP ספּעסיפיקאַטי, פאַרקערט טראַנסקריפּציע מיט הויך טערמאַל פעסטקייַט זאָל זיין געוויינט.היץ-סטאַביל פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע קענען זיין ינסאַלייטיד ביי העכער טעמפּעראַטורעס צו פאַרגרעסערן אָפּרוף שטרענגקייַט.צום ביישפּיל, אויב אַ GSP איז אַנניילד ביי 55 ° C, די ספּעסיפיקייט פון GSP איז נישט גאָר יוטאַלייזד אויב פאַרקערט טראַנסקריפּציע איז דורכגעקאָכט ביי 37 ° C מיט נידעריק שטרענגקייַט ניצן AMV אָדער M-MLV.אָבער, SuperScripⅡ און ThermoScript קענען רעאַגירן ביי 50 ℃ אָדער העכער, וואָס ילימאַנייץ ניט-ספּעציפיש פּראָדוקטן געשאפן אין נידעריקער טעמפּעראַטורעס.פֿאַר מאַקסימום ספּעציפֿישקייט, די רנאַ / אָנפאַנגער געמיש קענען זיין טראַנספערד גלייַך פון די 65 ℃ דענאַטוראַטיאָן טעמפּעראַטור צו די פאַרקערט טראַנסקריפּציע האלטן טעמפּעראַטור מיט די אַדישאַן פון אַ פּרעהעאַטעד 2 רענטגענ אָפּרוף געמיש (טערמאַל ינישיישאַן פון cDNA סינטעז).דאָס העלפּס צו פאַרמייַדן באַזע פּערינג צווישן מאַלאַקיולז ביי נידעריק טעמפּעראַטורעס.ניצן אַ פּקר קיילע סימפּלאַפייז די פילע טעמפּעראַטור טראַנזישאַנז פארלאנגט פֿאַר RT-PCR.
3. רעדוצירן גענאָמיק דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן:
איין פּאָטענציעל שוועריקייט מיט RT-PCR איז אַז רנאַ קאַנטאַמאַנייט גענאָמיק דנאַ.די נוצן פון בעסער רנאַ צעשיידונג מעטהאָדס, אַזאַ ווי טריזאָל רעאַגענט, ראַדוסאַז גענאָמיק דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן אין רנאַ פּרעפּעריישאַנז.צו ויסמיידן פּראָדוקטן געשאפן פון גענאָמיק דנאַ, די רנאַ קענען זיין באהאנדלט מיט אַמפּלאַפאַקיישאַן גראַד דנאַסⅠ צו באַזייַטיקן קאַנטאַמאַנייטאַד דנאַ איידער פאַרקערט טראַנסקריפּציע.די סאַמפּאַלז זענען געהאלטן ביי 65 ℃ אין 2.0 מם עדטאַ פֿאַר 10 מינוט צו פאַרענדיקן DNaseⅠ דיידזשעסטשאַן.עדטאַ טשעלייץ מאַגניזיאַם ייאַנז צו פאַרמייַדן מאַגניזיאַם יאָן אָפענגיק רנאַ כיידראַלאַסאַס וואָס אַקערז ביי הויך טעמפּעראַטורעס.
אין סדר צו צעטיילן אַמפּלאַפייד cDNA פון די גענאָמע דנאַ אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט, אָנפאַנגערס וואָס אַנאַלייז סעפּעראַטלי מיט די אפגעשיידט עקסאָן קענען זיין דיזיינד.פּקר פּראָדוקטן דערייווד פון cDNA וועט זיין קירצער ווי די דערייווד פון קאַנטאַמאַנייטאַד גענאָמיק דנאַ.א קאַנטראָולד עקספּערימענט אָן פאַרקערט טראַנסקריפּציע איז אויך דורכגעקאָכט אויף יעדער רנאַ מוסטער צו באַשליסן צי אַ געגעבן פראַגמענט איז פֿון גענאָמיק דנאַ אָדער קדנאַ.פּקר פּראָדוקטן באקומען אין דער אַוועק פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע זענען דערייווד פון די גענאָמע.
פֿאַרבונדענע פּראָדוקט
רט-פּקר גרינגᵀᴹאיך (איין שריט)
-די איין-שריט קיט ינייבאַלז פאַרקערט טראַנסקריפּציע און פּקר צו זיין דורכגעקאָכט אין דער זעלביקער רער.עס נאָר דאַרף צו לייגן טעמפּלאַטע רנאַ, ספּעציפיש פּקר פּרימערז און רנאַסע-פריי דדה2O.
- פאַקטיש-צייט קוואַנטיטאַטיווע אַנאַליסיס פון רנאַ קענען זיין דורכגעקאָכט געשווינד און אַקיעראַטלי.
-די קיט ניצט אַ יינציק Foregene פאַרקערט טראַנסקריפּציע רייידזשאַנט און Foregene HotStar Taq DNA פּאָלימעראַסע קאַמביינד מיט אַ יינציק אָפּרוף סיסטעם צו יפעקטיוולי פֿאַרבעסערן די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט און ספּעציפֿישקייט פון דער אָפּרוף.
-די אָפּטימיזעד אָפּרוף סיסטעם מאכט דער אָפּרוף האָבן העכער דיטעקשאַן סענסיטיוויטי, שטארקער טערמאַל פעסטקייַט און בעסער טאָלעראַנץ.
- עפעקטיוו פיייקייט צו באַזייַטיקן gDNA, וואָס קענען באַזייַטיקן GDNA אין די מוסטער אין 2 מינוט.
- עפעקטיוו פאַרקערט טראַנסקריפּציע סיסטעם, עס נעמט בלויז 15 מינוט צו פאַרענדיקן די סינטעז פון דער ערשטער שנירל קדנאַ.
-קאָמפּלעקס טעמפּלאַטעס: טעמפּלאַטעס מיט הויך גק אינהאַלט און קאָמפּלעקס צווייטיק סטרוקטור קענען אויך זיין ריווערסט מיט הויך עפעקטיווקייַט.
- הויך סענסיטיוויטי פאַרקערט טראַנסקריפּציע סיסטעם, פּג-מדרגה טעמפּלאַטעס קענען אויך באַקומען הויך-קוואַליטעט קדנאַ.
-די פאַרקערט טראַנסקריפּציע סיסטעם האט הויך טערמאַל פעסטקייַט, די אָפּטימאַל אָפּרוף טעמפּעראַטור איז 42 ℃, און עס נאָך האט אַ גוט פאַרקערט טראַנסקריפּציע פאָרשטעלונג ביי 50 ℃.
פּאָסטן צייט: מאַרץ 07-2023
