ווי אַ נייַע אין דער לאַבאָראַטאָריע, עס איז נישט אַ גוט אַרבעט צו ויסמעקן positive געוויקסן פון אַ בינטל פון געוויקסן מיט אַ נידעריק קאַנווערזשאַן קורס.ערשטער, דנאַ מוזן זיין יקסטראַקטיד פון אַ גרויס נומער פון סאַמפּאַלז איינער דורך איינער, און די פרעמד גענעס וועט זיין דיטעקטאַד דורך פּקר.אָבער, די רעזולטאַטן זענען אָפט בלאַנקס און באַנדס מיט אַ ביסל זאכן טייל מאָל, אָבער עס איז אוממעגלעך צו באַשליסן צי עס זענען מיסט דיטעקשאַנז אָדער פאַלש דיטעקשאַנז..איז עס זייער אָפענטיק צו פּנים אַזאַ יקספּערמענאַל פּראָצעס און רעזולטאַטן?צי ניט זאָרג, ברודער לערנט איר ווי צו ויסמעקן טראַנסגעניק positive געוויקסן לייכט און אַקיעראַטלי.

שריט 1

פּלאַן דיטעקשאַן פּרימערז

באַשטימען די ענדאָגענאָוס דזשין און עקסאָגענאָוס דזשין צו זיין דיטעקטאַד לויט די מוסטער צו זיין טעסטעד, און סעלעקטירן אַ רעפּריזענאַטיוו 100-500bp סיקוואַנס אין די דזשין פֿאַר אָנפאַנגער פּלאַן.גוט אָנפאַנגער קענען ענשור די אַקיעראַסי פון די דיטעקשאַן רעזולטאַטן און פאַרקירצן די דיטעקשאַן צייט (זען די אַפּפּענדיקס פֿאַר קאַמאַנלי געוויינט דיטעקשאַן אָנפאַנגער).

נאָטיץ: די ניי דיזיינד פּרימערז דאַרפֿן צו אַפּטאַמייז די אָפּרוף טנאָים און באַשטעטיקן די אַקיעראַסי, פּינטלעכקייַט און דיטעקשאַן שיעור פון די דיטעקשאַן איידער גרויס-וואָג דיטעקשאַן.

שריט 2

פּלאַן יקספּערמענאַל פּראָטאָקאָל

Positive קאָנטראָל: ניצן די פּיוראַפייד דנאַ מיט די ציל פראַגמענט ווי אַ מוסטער צו באַשליסן צי די PCR אָפּרוף סיסטעם און טנאָים זענען נאָרמאַל.

נעגאַטיוו / פּוסט קאָנטראָל: ניצן די דנאַ מוסטער אָדער דדה2אָ וואָס טוט נישט אַנטהאַלטן דעם ציל פראַגמענט ווי אַ מוסטער צו דעטעקט צי עס איז אַ מקור פון קאַנטאַמאַניישאַן אין די פּקר סיסטעם.

ינערלעך רעפֿערענץ קאָנטראָל: ניצן די אָנפאַנגער / זאָנד קאָמבינאַציע פון ​​​​די ענדאָגענאָוס דזשין פון די מוסטער צו זיין טעסטעד צו אָפּשאַצן צי די מוסטער קענען זיין דיטעקטאַד דורך פּקר.

נאָטיץ:

positive, נעגאַטיוו / פּוסט קאָנטראָלס און ינערלעך קאָנטראָל קאָנטראָלס זאָל זיין באַשטימט פֿאַר יעדער פּראָבע צו אָפּשאַצן די גילטיקייַט פון די יקספּערמענאַל רעזולטאַטן.

עקספּערימענט צוגרייטונג

איידער נוצן, אָבסערווירן צי די לייזונג איז יוואַנלי געמישט.אויב עס איז געפֿונען אַ אָפּזאַץ, עס דאַרף זיין צעלאָזן און געמישט לויט די ינסטראַקשאַנז איידער נוצן.2 × פּקר מישן דאַרף זיין פּיפּעטטיד און ריפּיטידלי געמישט מיט אַ מיקראָפּיפּעטטע איידער נוצן צו ויסמיידן אַניוואַן יאָן פאַרשפּרייטונג.

נאָטיץ:

נעמען אויס די מאַנואַל און לייענען עס קערפאַלי, און מאַכן פּרעפּעריישאַנז איידער דער עקספּערימענט אין שטרענג לויט מיט די באדערפענישן פון די מאַנואַל.

שריט 4

צוגרייטן פּקר אָפּרוף סיסטעם

לויט די יקספּערמענאַל פּראָטאָקאָל, מישן די אָנפאַנגער, H2O און 2×PCR מישן יוואַנלי, סענטריפודזש און פאַרשפּרייטן זיי צו יעדער אָפּרוף רער.

נאָטיץ:

פֿאַר גרויס-וואָג אָדער לאַנג-טערמין טעסטינג, עס איז רעקאַמענדיד צו נוצן אַ פּקר אָפּרוף סיסטעם מיט UNG ענזיים, וואָס קענען יפעקטיוולי ויסמיידן אַעראָסאָל קאַנטאַמאַניישאַן געפֿירט דורך פּקר פּראָדוקטן.

שריט 5

לייג אָפּרוף מוסטער

ניצן דירעקט פּקר טעכנאָלאָגיע, עס איז ניט נויטיק פֿאַר טידיאַס רייניקונג פּראָצעס פון נוקלעיק זויער, די מוסטער מוסטער קענען זיין צוגעגרייט אין 10 מינוט, און די קאָראַספּאַנדינג פּקר אָפּרוף סיסטעם קענען זיין מוסיף.

נאָטיץ:

די קלעאַוואַגע אופֿן האט אַ בעסער דיטעקשאַן ווירקונג, און די באקומען פּראָדוקט קענען זיין געוויינט פֿאַר קייפל דיטעקשאַן ריאַקשאַנז.

5.1: דירעקט יקספּאַנשאַן פון בלעטער

לויט די גרייס פון די בילד אין די מאַנואַל, שנייַדן די בלאַט געוועב מיט אַ דיאַמעטער פון 2-3 מם און שטעלן עס אין די פּקר אָפּרוף סיסטעם.

באַמערקונג: ענשור אַז די בלאַט פראַגמאַנץ זענען גאָר געטובלט אין די פּקר אָפּרוף לייזונג, און טאָן ניט לייגן יבעריק בלאַט געוועב.

5.2: בלאַט שפּאַלטן אופֿן

שנייַדן די בלאַט געוועב מיט אַ דיאַמעטער פון 5-7 מם און שטעלן עס אין אַ סענטריפודזש רער.אויב איר קלייַבן דערוואַקסן בלעטער, ביטע ויסמייַדן ניצן די געוועבן פון די הויפּט אָדער פון די בלאַט.פּיפּעטט 50ul Buffer P1 ליסאַטע אין אַ סענטריפודזש רער צו ענשור אַז די ליסאַטע קענען גאָר ייַנטונקען די בלאַט געוועב, שטעלן עס אין אַ טערמאַל סייקאַלער אָדער אַ מעטאַל וואַנע, און ליסע ביי 95 ° C פֿאַר 5-10 מינוט.

לייג 50ul Buffer P2 נוטראַלייזינג לייזונג און מישן געזונט.די ריזאַלטינג ליסאַטע קענען זיין געוויינט ווי אַ מוסטער און צוגעלייגט צו די PCR אָפּרוף סיסטעם.

באַמערקונג: די סומע פון ​​​​טעמפּלאַטע איז צווישן 5-10% פון די פּקר סיסטעם, און זאָל נישט יקסיד 20% (למשל, אין אַ 20μל פּקר סיסטעם, לייגן 1-2μל ליסיס לייזונג, נישט מער ווי 4μל).

שריט 6

פּקר אָפּרוף

נאָך סענטריפוגינג די פּקר אָפּרוף רער, עס איז געשטעלט אין אַ פּקר קיילע פֿאַר אַמפּלאַפאַקיישאַן.

נאָטיץ:

דער אָפּרוף ניצט ניט-פּיוראַפייד מוסטער פֿאַר אַמפּלאַפאַקיישאַן, אַזוי די נומער פון אַמפּלאַפאַקיישאַן סייקאַלז איז 5-10 מער סייקאַלז ווי ווען ניצן פּיוראַפייד דנאַ מוסטער.

שריט 7

עלעקטראָפאָרעסיס דיטעקשאַן און רעזולטאַט אַנאַליסיס

ב: 100 בפּ דנאַ לאַדער

1\4: פּיוראַפייד דנאַ אופֿן

2\5: דירעקט פּקר אופֿן

3\6: ליידיק קאָנטראָל

QC:

די פּראָבע רעזולטאַטן פון די פאַרשידן קאָנטראָלס שטעלן אין דער עקספּערימענט זאָל טרעפן די פאלגענדע טנאָים.אַנדערש, די סיבה פון דעם פּראָבלעם זאָל זיין אַנאַלייזד, און די פּראָבע זאָל זיין דורכגעקאָכט ווידער נאָך די פּראָבלעם איז ילימאַנייטאַד.

טיש 1. נאָרמאַל פּרובירן רעזולטאַטן פון פאַרשידן קאָנטראָל גרופּעס

* ווען די פּלאַזמיד איז געניצט ווי אַ positive קאָנטראָל, די ענדאָגענאָוס דזשין פּרובירן רעזולטאַט קענען זיין נעגאַטיוו

רעזולטאַט משפט:

A. דער פּראָבע רעזולטאַט פון די ענדאָגענאָוס דזשין פון די מוסטער איז נעגאַטיוו, וואָס ינדיקייץ אַז די דנאַ פּאַסיק פֿאַר פּראָסט פּקר דיטעקשאַן קענען ניט זיין יקסטראַקטיד פון די מוסטער אָדער די יקסטראַקטיד דנאַ כּולל פּקר אָפּרוף ינכיבאַטערז, און די דנאַ זאָל זיין יקסטראַקטיד ווידער.

בי די פּראָבע רעזולטאַט פון די ענדאָגענאָוס דזשין פון די מוסטער איז positive, און די פּראָבע רעזולטאַט פון די עקסאָגענאָוס דזשין איז נעגאַטיוו, וואָס ינדיקייץ אַז דנאַ פּאַסיק פֿאַר פּראָסט פּקר דיטעקשאַן איז יקסטראַקטיד פון די מוסטער, און עס קענען זיין געמשפט אַז די XXX דזשין איז נישט דיטעקטאַד אין די מוסטער.

C. דער פּראָבע רעזולטאַט פון די ענדאָגענאָוס דזשין פון די מוסטער איז positive, און די פּראָבע רעזולטאַט פון די עקסאָגענאָוס דזשין איז positive, וואָס ינדיקייץ אַז דנאַ פּאַסיק פֿאַר פּראָסט פּקר דיטעקשאַן איז יקסטראַקטיד פון די מוסטער, און די מוסטער דנאַ כּולל די קסקסקס דזשין.באַשטעטיקונג יקספּעראַמאַנץ קענען זיין ווייַטער דורכגעקאָכט.

שריט 8

פּלאַן דיטעקשאַן פּרימערז

נאָך דער עקספּערימענט, נוצן 2% סאָדיום היפּאָטשלאָריט לייזונג און 70% עטאַנאָל לייזונג צו ווישן די יקספּערמענאַל געגנט צו פאַרמייַדן ינווייראַנמענאַל פאַרפּעסטיקונג.