RT-qPCR איז דעוועלאָפּעד פֿון פּראָסט פּקר טעכנאָלאָגיע.עס מוסיף פלורעסאַנט קעמיקאַלז (פלאָרעסאַנט דייז אָדער פלורעסאַנט פּראָבעס) צו די טראדיציאנעלן פּקר אָפּרוף סיסטעם, און דיטעקץ די פּקר אַנילינג און פאַרלענגערונג פּראָצעס אין פאַקטיש צייט לויט זייער פאַרשידענע לומאַנעסאַנט מעקאַניזאַמז.פלואָרעססענט סיגנאַל ענדערונגען אין די מיטל זענען געניצט צו רעכענען די סומע פון ​​פּראָדוקט ענדערונג אין יעדער פּקר ציקל.דערווייַל, די מערסט פּראָסט מעטהאָדס זענען פלורעסאַנט פאַרב און זאָנד אופֿן.

פלורעסאַנט פאַרב אופֿן:
עטלעכע פלורעסאַנט דיעס, אַזאַ ווי SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, אאז"ו ו, טאָן ניט אַרויסלאָזן ליכט אַליין, אָבער אַרויסלאָזן פלורעסאַנס נאָך ביינדינג צו די מינערווערטיק נאָרע פון ​​דסדנאַ.דעריבער, אין די אָנהייב פון די פּקר אָפּרוף, די מאַשין קענען נישט דעטעקט די פלורעסאַנט סיגנאַל.ווען דער אָפּרוף גייט צו די אַנילינג-פאַרלענגערונג (צוויי-שריט אופֿן) אָדער פאַרלענגערונג בינע (דריי-שריט אופֿן), די טאָפּל סטראַנדז זענען געעפנט אין דעם צייט, און די נייַ דנאַ פּאָלימעראַסע בעשאַס שנירל סינטעז, פלורעסאַנט מאַלאַקיולז זענען קאַמביינד אין די דסדנאַ מינערווערטיק נאָרע און אַרויסלאָזן פלורעסאַנס.ווי די נומער פון פּקר סייקאַלז ינקריסיז, מער און מער דייז פאַרבינדן מיט דסדנאַ, און די פלורעסאַנט סיגנאַל איז אויך קאַנטיניואַסלי ימפּרוווד.נעמען SYBR Green Ⅰ ווי אַ בייַשפּיל.
פּראָבע אופֿן:
טאַקמאַן זאָנד איז די מערסט קאַמאַנלי געניצט כיידראַלאַסאַס זאָנד.עס איז אַ פלורעסאַנט גרופּע אין די 5′ סוף פון די זאָנד, יוזשאַוואַלי FAM.די זאָנד זיך איז אַ סיקוואַנס קאַמפּלאַמענטשי צו די ציל דזשין.עס איז אַ פלורעסאַנט קווענטשינג גרופּע אין די 3′ סוף פון די פלואָראָפאָר.לויט דעם פּרינציפּ פון פלורעסאַנס אפקלאנג ענערגיע אַריבערפירן (Förster אפקלאנג ענערגיע אַריבערפירן, FRET), ווען די רעפּאָרטער פלורעסאַנט גרופּע (מענאַדעוו פלורעסאַנט מאַלאַקיול) און די קווענטשינג פלורעסאַנט גרופּע (אַקסעפּטאָר פלורעסאַנט מאַלאַקיול) ווען די עקסייטיישאַן ספּעקטרום אָוווערלאַפּס און די דיסטאַנסע איז זייער נאָענט (7-10 מאל די פלואָרעסס פון די קענען). די אַקסעפּטאָר מאַלאַקיול, בשעת די אַוטאָפלאָרעססענסע איז וויקאַנד.דעריבער, אין די אָנהייב פון די פּקר אָפּרוף, ווען די זאָנד איז פריי און בעשאָלעם אין די סיסטעם, די רעפּאָרטער פלורעסאַנט גרופּע וועט נישט אַרויסלאָזן פלורעסאַנס.ווען אַנילינג, די אָנפאַנגער און זאָנד בינדן צו די מוסטער.בעשאַס די פאַרלענגערונג בינע, די פּאָלימעראַסע קאַנטיניואַסלי סינטאַסייזיז נייַע קייטן.דנאַ פּאָלימעראַסע האט 5′-3′ עקסאָנוקלעאַסע טעטיקייט.ווען ריטשינג די זאָנד, די דנאַ פּאָלימעראַסע וועט כיידראַליזירן די זאָנד פון די מוסטער, באַזונדער די רעפּאָרטער פלורעסאַנט גרופּע פון ​​די קווענטשער פלורעסאַנט גרופּע און מעלדונג די פלורעסאַנט סיגנאַל.זינט עס איז אַ איין-צו-איינער שייכות צווישן די זאָנד און די מוסטער, די זאָנד אופֿן איז העכער ווי די פאַרב אופֿן אין טערמינען פון די אַקיעראַסי און סענסיטיוויטי פון די פּראָבע.

פייַג 1 פּרינציפּ פון qRT-PCR

אָנפאַנגער פּלאַן
פּרינציפּן:

די פּרימערז זאָל זיין דיזיינד אין די קאַנסערווד געגנט פון די נוקלעיק זויער סעריע און האָבן ספּעסיפיקאַטי.

עס איז בעסטער צו נוצן cDNA סיקוואַנס, און mRNA סיקוואַנס איז אויך פּאַסיק.אויב ניט, געפינען אויס די CDs געגנט פּלאַן פון די דנאַ סיקוואַנס.
די לענג פון די פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּראָדוקט איז 80-150 בפּ, די לאָנגעסט איז 300 בפּ, די אָנפאַנגער לענג איז בכלל צווישן 17-25 באַסעס, און די חילוק צווישן די אַפּסטרים און דאַונסטרים פּרימערז זאָל נישט זיין צו גרויס.

די G + C אינהאַלט איז צווישן 40% און 60%, און 45-55% איז דער בעסטער.
די טם ווערט איז צווישן 58-62 דיגריז.
פּרוּווט צו ויסמיידן אָנפאַנגער דימערז און זיך-דימערז, (זיין ניט מער ווי 4 פּערז פון קאָנסעקוטיווע קאַמפּלאַמענטשי באַסעס) האָר שפּילקע סטרוקטור, אויב אַנאַוווידאַבאַל, מאַכן ΔG<4.5kJ/mol* אויב איר קענען נישט ענשור אַז גדנאַ איז אַוועקגענומען בעשאַס פאַרקערט טראַנסקריפּציע ריין, עס איז בעסטער צו פּלאַן די אָנפאַנגער פון די ינטראָן און ענד ′ קענען ניט ויסמיידן די פּרימערז פון די ינטראָן און 3 מאָד. /C, א / ג קעסיידערדיק סטרוקטור (2-3) אָנפאַנגער און ניט-
ספּעציפיש די כאָומאַלאַדזשי פון די העטעראַדזשיניאַסלי אַמפּלאַפייד סיקוואַנס איז פּרעפעראַבלי ווייניקער ווי 70% אָדער האט 8 קאַמפּלאַמענטשי באַזע כאָומאַלאַדזשי.
דאַטאַבאַסע:
CottonFGD זוכן דורך טערמינען
אָנפאַנגער פּלאַן:
IDT-qPCR אָנפאַנגער פּלאַן

Fig2 IDT אָנליין אָנפאַנגער פּלאַן געצייַג בלאַט

פיג3 רעזולטאַט בלאַט אַרויסווייַזן
פּלאַן פון lncRNA פּרימערז:
lncRNA:די זעלבע סטעפּס ווי מרנאַ.
מירנאַ:דער פּרינציפּ פון די סטעם-שלייף אופֿן: זינט אַלע מירנאַס זענען קורץ סיקוואַנסיז פון וועגן 23 נט, דירעקט פּקר דיטעקשאַן קענען ניט זיין דורכגעקאָכט, אַזוי די סטעם-שלייף סיקוואַנס געצייַג איז געניצט.די סטעם-שלייף סיקוואַנס איז אַ איין-סטראַנדיד דנאַ פון וועגן 50 נט, וואָס קענען פאָרעם אַ האַירפּין סטרוקטור דורך זיך.3 'דער סוף קענען זיין דיזיינד ווי אַ סיקוואַנס קאַמפּלאַמענטשי צו די מירנאַ פּאַרטיייש פראַגמענט, דער ציל מירנאַ קענען זיין פארבונדן צו די סטעם-שלייף סיקוואַנס בעשאַס פאַרקערט טראַנסקריפּציע, און די גאַנץ לענג קענען דערגרייכן 70 בפּ, וואָס איז אין שורה מיט די לענג פון די אַמפּלאַפייד פּראָדוקט באשלאסן דורך qPCR.טיילינג מירנאַ אָנפאַנגער פּלאַן.
אַמפּלאַפאַקיישאַן-ספּעציפיש דיטעקשאַן:
אָנליין בלאַסט דאַטאַבייס: CottonFGD בלאַסט דורך סיקוואַנס ענלעכקייט
לאקאלע בלאַסט: אָפּשיקן צו ניצן בלאַסט + צו טאָן היגע בלאַסט, לינוקס און מאַקאָס קענען גלייַך פאַרלייגן אַ היגע דאַטאַבייס, ווינ10 סיסטעם קענען אויך זיין געטאן נאָך ינסטאָלינג ובונטו באַש.שאַפֿן היגע בלאַסט דאַטאַבייס און היגע בלאַסט;עפענען ובונטו באַש אויף ווינ10.
נאָטיץ: אַפּלאַנד וואַטע און ים אינזל וואַטע זענען טעטראַפּלאָיד קראַפּס, אַזוי דער רעזולטאַט פון בלאַסט וועט אָפט זיין צוויי אָדער מער שוועבעלעך.אין דער פאַרגאַנגענהייט, ניצן NAU CDs ווי אַ דאַטאַבייס צו דורכפירן בלאַסט איז מסתּמא צו געפֿינען צוויי האָמאָלאָגאָוס גענעס מיט בלויז אַ ביסל SNP דיפעראַנסיז.יוזשאַוואַלי, די צוויי האָמאָלאָגאָוס גענעס קענען ניט זיין אפגעשיידט דורך אָנפאַנגער פּלאַן, אַזוי זיי זענען באהאנדלט ווי די זעלבע.אויב עס איז אַ קלאָר ווי דער טאָג ינדעל, דער אָנפאַנגער איז יוזשאַוואַלי דיזיינד אויף די ינדעל, אָבער דאָס קען פירן צו די צווייטיק סטרוקטור פון די אָנפאַנגער. די פריי ענערגיע ווערט העכער, וואָס פירן צו אַ פאַרקלענערן אין אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט, אָבער דאָס איז אַנאַוווידאַבאַל.

דיטעקשאַן פון אָנפאַנגער צווייטיק סטרוקטור:
סטעפּס:עפענען אָליגאָ 7 → אַרייַנשרייַב מוסטער סיקוואַנס → נאָענט סאַב-פֿענצטער → ראַטעווען → געפינען אָנפאַנגער אויף מוסטער, דריקן קטרל + ד צו שטעלן אָנפאַנגער לענג → פונאַנדערקלייַבן פאַרשידן צווייטיק סטראַקטשערז, אַזאַ ווי זיך-דימעריזיישאַן גוף, העטעראָדימער, האָר שפּילקע, מיסמאַטש, אאז"ו ו. די לעצטע צוויי בילדער אין פיגורע 4 זענען די פּרובירן רעזולטאַטן פון די אָנפאַנגערס.דער רעזולטאַט פון די פראָנט אָנפאַנגער איז גוט, עס איז קיין קלאָר ווי דער טאָג דימער און האַירפּין סטרוקטור, קיין קעסיידערדיק קאַמפּלאַמענטשי באַסעס, און די אַבסאָלוט ווערט פון פריי ענערגיע איז ווייניקער ווי 4.5, בשעת די צוריק אָנפאַנגער ווייזט קעסיידערדיק די 6 באַסעס זענען קאַמפּלאַמענטשי, און די פריי ענערגיע איז 8.8;אין דערצו, אַ מער ערנסט דימער איז ארויס אין די 3′ סוף, און אַ דימער פון 4 קאָנסעקוטיווע באַסעס.כאָטש די פריי ענערגיע איז נישט הויך, די 3′ דימער קל קענען עמעס ווירקן אַמפּלאַפאַקיישאַן ספּעסיפיקאַטי און אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט.אין דערצו, עס איז נייטיק צו קאָנטראָלירן פֿאַר האַירפּינס, העטעראָדימערז און מיסמאַטשעס.

פיג3 oligo7 דיטעקשאַן רעזולטאַטן
אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט דיטעקשאַן:
די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט פון די פּקר אָפּרוף אַפעקץ די פּקר רעזולטאַטן.אויך אין qRT-PCR, די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט איז דער הויפּט וויכטיק פֿאַר די קוואַנטיטאַטיווע רעזולטאַטן.אַראָפּנעמען אנדערע סאַבסטאַנסיז, מאשינען און פּראָטאָקאָלס אין דער אָפּרוף באַפער.די קוואַליטעט פון די פּרימערז אויך האט אַ גרויס השפּעה אויף די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט פון QRT-PCR.אין סדר צו ענשור די אַקיעראַסי פון די רעזולטאַטן, ביידע די קאָרעוו פלואָרעססענסע קוואַנטאַפאַקיישאַן און די אַבסאָלוט פלואָרעססענסע קוואַנטאַפאַקיישאַן דאַרפֿן צו דעטעקט די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט פון די אָנפאַנגער.עס איז דערקענט אַז די עפעקטיוו qRT-PCR אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט איז צווישן 85% און 115%.עס זענען צוויי מעטהאָדס:
1. נאָרמאַל ויסבייג אופֿן:
א.מישן cDNA
ב.גראַדיענט דיילושאַן
c.qPCR
ד.לינעאַר ראַגרעשאַן יקווייזשאַן צו רעכענען די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט
2. לינרעגפּקר
LinRegPCR איז אַ פּראָגראַם פֿאַר אַנאַליסיס פון פאַקטיש צייט RT-PCR דאַטן, אויך גערופן קוואַנטיטאַטיווע פּקר (qPCR) דאַטן באזירט אויף SYBR גרין אָדער ענלעך כעמיע.דער פּראָגראַם ניצט ניט-באַסעלינע קערעקטאַד דאַטן, פּערפאָרמז אַ באַסעלינע קערעקשאַן אויף יעדער מוסטער סעפּעראַטלי, דיטערמאַנז אַ פֿענצטער-פון-לינעאַריטי און דעמאָלט ניצט לינעאַר ראַגרעשאַן אַנאַליסיס צו פּאַסיק אַ גלייַך שורה דורך די פּקר דאַטן שטעלן.פֿון דעם שיפּוע פון ​​דעם שורה די פּקר עפעקטיווקייַט פון יעדער יחיד מוסטער איז קאַלקיאַלייטיד.די דורכשניטלעך פּקר עפעקטיווקייַט פּער אַמפּליקאָן און די Ct ווערט פּער מוסטער זענען געניצט צו רעכענען אַ סטאַרטינג קאַנסאַנטריישאַן פּער מוסטער, אויסגעדריקט אין אַרביטראַריש פלואָרעססענסע וניץ.דאַטן אַרייַנשרייַב און רעזולטאַט זענען דורך אַן עקססעל ספּרעדשיט.בלויז מוסטער
מיקסינג איז פארלאנגט, קיין גראַדיענט
סטעפּס זענען פארלאנגט:(נעמען Bole CFX96 ווי אַ בייַשפּיל, נישט גאַנץ מאַשין מיט קלאָר אַבי)
עקספּערימענט:עס איז אַ נאָרמאַל קפּקר עקספּערימענט.
qPCR דאַטן רעזולטאַט:LinRegPCR קענען דערקענען צוויי פארמען פון רעזולטאַט טעקעס: RDML אָדער קוואַנטיפיקאַטיאָן אַמפּלאַפאַקיישאַן רעזולטאַט.אין פאַקט, דאָס איז די פאַקטיש-צייט דיטעקשאַן ווערט פון די ציקל נומער און פלואָרעססענסע סיגנאַל דורך די מאַשין, און די אַמפּלאַפאַקיישאַן איז באקומען דורך אַנאַלייזינג די פלואָרעססענסע טוישן ווערט פון די לינעאַר אָפּשניט עפעקטיווקייַט.
דאַטאַ סעלעקציע: אין טעאָריע, די RDML ווערט זאָל זיין ניצלעך.עס איז עסטימאַטעד אַז די פּראָבלעם פון מיין קאָמפּיוטער איז אַז די ווייכווארג קען נישט דערקענען RDML, אַזוי איך האָבן די עקססעל רעזולטאַט ווערט ווי די אָריגינעל דאַטן.עס איז רעקאַמענדיד צו דורכפירן אַ פּראָסט זיפּונג פון די דאַטן ערשטער, אַזאַ ווי די דורכפאַל פון אַדינג סאַמפּאַלז, אאז"ו ו. די פונקטן קענען זיין אויסגעמעקט אין די רעזולטאַט דאַטן (פון קורס, איר קענען נישט ויסמעקן זיי, LinRegPCR וועט איגנאָרירן די פונקטן אין די שפּעטער בינע)

פייג 5 קפּקר דאַטן אַרויספירן

פיג6 סעלעקציע פון ​​קאַנדידאַט סאַמפּאַלז

דאַטן אַרייַנשרייַב:עפֿענען קוואַליפיקאַציע אַמפּלאַפאַקיישאַן רעזולטאטן.קסלס, → עפענען LinRegPCR → טעקע → לייענען פֿון עקססעל → אויסקלייַבן פּאַראַמעטערס ווי געוויזן אין פיגורע 7 → OK → גיט באַשטימען באַסליינז

פייג 7 סטעפּס פון LinRegPCR דאַטן אַרייַנשרייַב

רעזולטאט:אויב עס איז קיין יבערכאַזערונג, קיין גרופּינג איז פארלאנגט.אויב עס איז יבערכאַזערונג, די גרופּינג קענען זיין עדיטיד אין די מוסטער גרופּינג, און די נאָמען פון די דזשין איז אריין אין די אידענטיטעט, און דער זעלביקער דזשין וועט זיין אויטאָמאַטיש גרופּט.צום סוף, גיט אויף די טעקע, אַרויספירן יקסעל און קוק די רעזולטאַטן.די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט און R2 רעזולטאַטן פון יעדער געזונט וועט זיין געוויזן.צווייטנס, אויב איר טיילן אין גרופּעס, די קערעקטאַד דורכשניטלעך אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט וועט זיין געוויזן.פאַרזיכערן אַז די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט פון יעדער אָנפאַנגער איז צווישן 85% און 115%.אויב עס איז צו גרויס אָדער צו קליין, עס מיטל אַז די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט פון די אָנפאַנגער איז נעבעך.

פייַג 8 רעזולטאַט און דאַטן רעזולטאַט

עקספּערימענטאַל פּראָצעס:
RNA קוואַליטעט באדערפענישן:
ריינקייט:1.72.0 ינדיקייץ אַז עס קען זיין ריזידזשואַל יסאָטהיאָסיאַנאַטע.ריין נוקלעיק זויער אַ260 / אַ230 זאָל זיין אַרום 2. אויב עס איז אַ שטאַרק אַבזאָרפּשאַן בייַ 230 נם, עס ינדיקייץ אַז עס זענען אָרגאַניק קאַמפּאַונדז אַזאַ ווי פענאַטע ייאַנז.אין אַדישאַן, עס קענען זיין דיטעקטאַד דורך 1.5% אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.פונט די מאַרקער, ווייַל די ssRNA האט קיין דענאַטוראַטיאָן און די מאָלעקולאַר וואָג לאָגאַריטהם טוט נישט האָבן אַ לינעאַר שייכות, און די מאָלעקולאַר וואָג קענען ניט זיין ריכטיק אויסגעדריקט.קאַנסאַנטריישאַן: טעאָרעטישנישטווייניקער ווי 100ng/ul, אויב די קאַנסאַנטריישאַן איז צו נידעריק, די ריינקייַט איז בכלל נידעריק נישט הויך

פייג9 רנאַ געל

אין אַדישאַן, אויב די מוסטער איז טייַער און די רנאַ קאַנסאַנטריישאַן איז הויך, עס איז רעקאַמענדיד צו אַליקוואָט עס נאָך יקסטראַקשאַן, און צעפירן די רנאַ צו אַ לעצט קאַנסאַנטריישאַן פון 100-300ng / ul פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע.איןדער פּראָצעס פון פאַרקערט טראַנסקריפּציעווען מרנאַ איז טראַנסקריבעד, אָליגאָ (דט) אָנפאַנגערס וואָס קענען ספּאַסיפיקלי בינדן צו פּאָליאַ עקן זענען געניצט פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע, בשעת lncRNA און circRNA נוצן טראַפ העקסאַמער (ראַנדאָם 6 מער) אָנפאַנגערס פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע פון ​​גאַנץ רנאַ.פילע קאָמפּאַניעס האָבן איצט לאָנטשט ספּעציעל טיילינג קיץ.פֿאַר די סטעם-שלייף אופֿן, די טיילינג אופֿן איז מער באַקוועם, הויך-טרופּוט און רייידזשאַנט-שפּאָרן, אָבער די ווירקונג פון דיסטינגגווישינג מירנאַס פון דער זעלביקער משפּחה זאָל נישט זיין ווי גוט ווי די סטעם-שלייף אופֿן.יעדער פאַרקערט טראַנסקריפּציע קיט האט רעקווירעמענץ פֿאַר די קאַנסאַנטריישאַן פון דזשין-ספּעציפיש פּרימערז (סטעם-לופּס).די ינערלעך רעפֿערענץ געניצט פֿאַר מירנאַ איז U6.אין דעם פּראָצעס פון סטעם-שלייף ינווערזשאַן, אַ רער פון U6 זאָל זיין ריווערסט סעפּעראַטלי, און די פראָנט און צוריק אָנפאַנגער פון U6 זאָל זיין מוסיף גלייַך.ביידע circRNA און lncRNA קענען נוצן HKGs ווי ינערלעך רעפֿערענץ.איןcDNA דיטעקשאַן,
אויב עס איז קיין פּראָבלעם מיט רנאַ, cDNA זאָל אויך זיין גוט.אָבער, אויב די שליימעסדיק עקספּערימענט איז פּערסוד, עס איז בעסטער צו נוצן אַן ינערלעך רעפֿערענץ דזשין (רעפערענסע דזשין, RG) וואָס קענען ויסטיילן גדנאַ פון קדס.אין אַלגעמיין, RG איז אַ כאַוסקיפּינג דזשין., הקג) ווי געוויזן אין פיגורע 10;אין דער צייט, איך געמאכט סויבין סטאָרידזש פּראָטעין און געוויינט אַקטין 7 מיט ינטראָנז ווי אַן ינערלעך רעפֿערענץ.די גרייס פון די אַמפּלאַפייד פראַגמענט פון דעם אָנפאַנגער אין גדנאַ איז געווען 452bp, און אויב cDNA איז געניצט ווי אַ מוסטער, עס איז געווען 142bp.דערנאָך די פּראָבע רעזולטאַטן געפונען אַז טייל פון די cDNA איז פאקטיש קאַנטאַמאַנייטאַד דורך גדנאַ, און עס אויך פּרוווד אַז עס איז קיין פּראָבלעם מיט דער רעזולטאַט פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע, און עס קען זיין געוויינט ווי אַ מוסטער פֿאַר פּקר.עס איז אַרויסגעוואָרפן צו לויפן אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס גלייַך מיט cDNA, און עס איז אַ דיפיוז באַנד, וואָס איז נישט קאַנווינסינג.

פיגור 10 cDNA דיטעקשאַן

די באַשטימונג פון קפּקר טנאָיםאיז בכלל קיין פּראָבלעם לויט דעם פּראָטאָקאָל פון די קיט, דער הויפּט אין די שריט פון טם ווערט.אויב עטלעכע אָנפאַנגערס זענען נישט געזונט דיזיינד בעשאַס אָנפאַנגער פּלאַן, ריזאַלטינג אין אַ גרויס חילוק צווישן די טם ווערט און די טעאָרעטיש 60 ° C, עס איז רעקאַמענדיד אַז די cDNA נאָך די סאַמפּאַלז זענען געמישט, לויפן אַ גראַדיענט פּקר מיט אָנפאַנגער, און פּרובירן צו ויסמיידן באַשטעטיקן די טעמפּעראַטור אָן באַנדס ווי די טם ווערט.

דאַטאַ אַנאַליסיס

די קאַנווענשאַנאַל קאָרעוו פלואָרעססענסע קוואַנטיטאַטיווע פּקר פּראַסעסינג אופֿן איז בייסיקלי לויט 2-ΔΔCT.דאַטאַ פּראַסעסינג מוסטער.

פֿאַרבונדענע פּראָדוקטן:

פאַקטיש צייט פּקר גרינג^TM – טאַקמאַן

פאַקטיש צייט פּקר גרינג^TM –סיבר גרין I

RT Easy I (מאַסטער פּרעמיקס פֿאַר ערשטער שנירל קדנאַ סינטעז)

RT Easy II (מאַסטער פּרעמיקס פֿאַר ערשטער שנירל קדנאַ סינטעז פֿאַר קפּקר)