אַלעמען איז גערעדט וועגן דעם פּרינציפּ פון qRT-PCR עקספּערימענט, אָנפאַנגער פּלאַן, רעזולטאַט ינטערפּריטיישאַן, אאז"ו ו, אָבער איך טראַכטן איך זאָל טיילן מיט איר די יקספּערמענאַל אָפּעראַציע פון ​​qRT-PCR.עס איז קליין, אָבער עס איז וועגן רעזולטאַטן.

איידער מיר טאָן qRT-PCR, מיר דאַרפֿן צו האָבן אַ קלאָר פארשטאנד פון אונדזער אייגענע רנאַ און אָפּעראַציע מעטהאָדס.נאָך אַלע, אונדזער השתדלות זענען אַימעד צו באַקומען רעזולטאַטן, אלא ווי פשוט פּראַקטיסינג.אַזוי איידער מיר טאָן qRT-PCR, מיר דאַרפֿן צו באַשליסן די פאלגענדע ישוז (עטלעכע פון ​​​​וואָס זענען בלויז אָנווענדלעך צו SYBR).

1 זענט איר זיכער אַז דיין רנאַ איז נישט דיגריידיד?

נאַנאָדראָפּ 2000 קענען בלויז דעטעקט די קאַנסאַנטריישאַן און ריינקייַט פון רנאַ, אָבער קענען נישט דעטעקט די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ.

די רנאַ (רנאַ ינטענסיטי נומער) ווערט קענען פאַרטראַכטן די אָרנטלעכקייַט פון די רנאַ, וואָס איז דיטעקטאַד דורך די אַגילענט 2100 ביאָאַנאַליזער סיסטעם.

פיגורע סכעמאַטיש דיאַגראַמע פון ​​רין וואַלועס פֿאַר פאַרשידענע רנאַ סאַמפּאַלז (יוקאַריאָטעס)

אָבער, לאַבאָראַטאָריעס בכלל טאָן ניט האָבן אַגילענט 2100 ביאָאַנאַליזער.אין דעם פאַל, מיר קענען דעטעקט דורך פאָרמאַלדאַכייד געל, אָבער די פאָדערונג פֿאַר די גאַנץ סומע פון ​​רנאַ איז הויך, אַזוי די פאַסטאַסט אופֿן איז צו נוצן פּראָסט געל עלעקטראָפאָרעסיס.עס איז פארלאנגט צו זיין אין אַ נוקלעאַסע-פריי סוויווע, אַזוי עס איז נייטיק צו שווענקען די עלעקטראָפאָרעסיס טאַנק, סאָל פלאַש, געל קאַנטיקער און קאַם מיט דעפּק וואַסער.די אַגאַראָסע איז אויך נוקלעאַס-פֿרייַ (ווי לאַנג ווי עס איז פריש געעפנט), און די לאָודינג באַפער זאָל זיין פריש געעפנט ווי פיל ווי מעגלעך, מיט 1.2% געל.

באַמערקונג אַז די געל מוזן זיין גאָר צעלאָזן, אַנדערש עס וועט פאַרשאַפן ינכאָומאַדזשיניאַס באַנדס, ווי געוויזן אין מוסטער 9 אין די פיגור.אויב די וואָולטידזש איז צו הויך אָדער פליסנדיק פֿאַר צו לאַנג וועט דזשענערייט היץ און פאַרשאַפן רנאַ דערנידעריקונג, אַזוי די וואָולטידזש און צייט זאָל זיין קאַנטראָולד גלייַך.אין אַדישאַן, געל פליסנדיק קענען אויך באַשטימען צי עס איז דנאַ רעזאַדו אין דער מוסטער, און אָבסערווירן צי עס זענען אַ גרויס נומער פון ריטיינד באַנדס אין די דיספּענסינג געזונט.

פיגורע.געל עלעקטראָפאָרעסיס דיטעקשאַן פון רנאַ

2 זענט איר זיכער וועגן די קאַנסאַנטריישאַן פון דיין cDNA?

די דערפאַרונג פון די גרויס ברידער אין דער לאַבאָראַטאָריע איז אַז די cDNA פון די 20 ul סיסטעם באקומען דורך יעדער ינווערזשאַן איז גלייַך דיילוטאַד 20X, בשעת די פּאָסט-דאָקטאָראַל שוועסטער זענען דיילוטאַד 10X.איך יוזשאַוואַלי אָפענגען אויף די סיטואַציע.ווייַל די קוואַליטעט פון די רנאַ דערמאנט דורך יעדער מענטש איז אַנדערש, די מדרגה פון מאַפּאָלע איז אויך אַנדערש, און די מאַפּאָלע טעכנאָלאָגיע קען נישט זיין סטאַביל.

אַזוי יעדער מאָל איך באַקומען די ריווערסט cDNA, איך וועל ערשטער צעפירן עס וועגן 3 מאל, און דאַן נוצן די כאַוסקיפּינג דזשין צו טאָן RT-PCR, די נומער פון סייקאַלז איז בכלל 25 סייקאַלז, צו ידענטיפיצירן די ספּעציפיש קאַנסאַנטריישאַן, און דעמאָלט באַשטימען די לעצט דיילושאַן פאַקטאָר.

3 זענט איר זיכער אַז דיין פּרימערז זענען גרינג צו נוצן?

עס קען פאָרן די מעלטינג ויסבייג פון qRT-PCR, אָבער דאָס נאָך קאָס געלט.פֿאַר לאַבאָראַטאָריעס אָן אַ פּלאַץ פון געלט, ווען זיי באַקומען אַ פּלאַץ פון אָנפאַנגער, זיי קענען נוצן פּראָסט RT-PCR צו זען אויב עס איז אַ איין באַנד און ידענטיפיצירן די ספּעציפֿישקייט פון די אָנפאַנגער.אויב די לאַבאָראַטאָריע איז נישט קורץ פון געלט, די ספּעציפֿישקייט פון אַלע אָנפאַנגערס קענען זיין יידענאַפייד אַמאָל דורך די מעלטינג ויסבייג.

4 זענט איר זיכער אַז דיין יקספּערמענאַל טנאָים זענען פּאַסיק?

SYBR זאָל זיין פּראָטעקטעד פון שטאַרק ליכט, אַזוי פּרובירן צו ויסמעקן די אָוווערכעד ליכט ווען אַדינג SYBR רייידזשאַנט, און נאָר דאַרפֿן צו נוצן אַ טונקל ליכט צו פאַרענדיקן עס.

קראָם SYBR בייַ 4 °C.ווען אין נוצן, דזשענטלי יבערקערן אַרויף און אַראָפּ צו מישן געזונט צו ויסמיידן פאָומינג, און טאָן ניט וואָרטקס וויגעראַסלי.

עטלעכע יינגער שוועסטער ווי צו ציען מאַרקס אויף די פּקר ברעט פֿאַר מורא פון מיקסינג די סאַמפּאַלז, וואָס איז פאַלש.ווייַל דיין מאַרקערס זענען זייער מסתּמא צו ווירקן די זאַמלונג פון פלורעסאַנט סיגנאַלז, איך בכלל רעקאָמענדירן דזשוניערז צו נוצן יקספּערמענאַל נאָוטבוקס צו אַרוישעלפן אין זכּרון, ווי געוויזן אונטן.

פיגורע.qRT-PCR מוסטער לאָודינג דיאַגראַמע

5 זענט איר זיכער אַז איר טאָן דאָס רעכט?

זייט זיכער צו טראָגן גלאַווז, טראָגן גלאַווז, טראָגן גלאַווז, און זאָגן וויכטיק זאכן דרייַ מאָל.

אין סדר צו רעדוצירן די ויסשטעלן פון SYBR צו ליכט, איך פּערסנאַלי ווי צו לייגן אַ מוסטער ערשטער, ווי געוויזן אין די פיגור אונטן.לויט דערפאַרונג, די אַדישאַן פון אַ קליין סומע פון ​​מוסטער איז מסתּמא צו פאַרשאַפן מוסטערונג ערראָרס.דעריבער, אין סדר צו מינאַמייז די טעות געפֿירט דורך אַדינג אַ קליין סומע פון ​​מוסטער, איך יוזשאַוואַלי טאָפּל די מוסטער ווידער, און טאָפּל די סומע ווען אַדינג די מוסטער צו רעדוצירן די סומע פון ​​H2O2 צוגעגעבן.

פיגורע.סכעמאַטיש דיאַגראַמע פון ​​qRT-PCR לאָודינג

דערנאָך קאַנפיגיער די qRT-PCR סיסטעם ווי גייט.

פיגורע.qRT-PCR סיסטעם צוגרייטונג דיאַגראַמע

נאטיץ: די קאַנפיגיעריישאַן פּראָצעס דאַרף זיין געטאן אויף אייז.

נאָך אַדינג די מוסטער, פּאַפּ די טראַנספּעראַנט סילינג פילם.פּרובירן נישט צו פאַרבינדן די ייבערפלאַך פון די טראַנספּעראַנט סילינג פילם מיט דיין הענט, נאָר אַרבעטן פֿון די פּלאַץ אויף ביידע זייטן פון די פילם.ווייַל פינגגערפּרינץ קען אויך ווירקן די זאַמלונג פון פלורעסאַנט סיגנאַלז.דערנאָך נוצן אַ סענטריפודזש צו געשווינד סענטריפודזש פֿאַר 10 ס ביי נידעריק גיכקייַט צו פאַרמייַדן די מוסטער פון כאַנגגינג אויף די וואַנט.

פֿאַרבונדענע פּראָדוקטן:

צעל דירעקט רט-קפּקר קיט

רט יזי וו