פּקר (פּאָלימעראַסע קייט רעאַקציע) איז איינער פון די ינ-וויטראָ דנאַ אַמפּלאַפאַקיישאַן טעקנאַלאַדזשיז, מיט אַ געשיכטע פון ​​​​מער ווי 30 יאָר.

פּקר טעכנאָלאָגיע איז געווען פּייאַנירד דורך Kary Mullis פון Cetus, USA אין 1983. Mullis זיך געווענדט פֿאַר אַ פּקר פּאַטענט אין 1985 און ארויס די ערשטער פּקר אַקאַדעמיק פּאַפּיר אויף וויסנשאַפֿט אין די זעלבע יאָר.מולליס איז געווען אַוואָרדיד דעם נאָבעל פרייז אין כעמיע אין 1993 פֿאַר זיין אַרבעט.

יקערדיק פּרינסאַפּאַלז פון פּקר

פּקר קענען אַמפּלאַפיי ציל דנאַ פראַגמאַנץ מיט מער ווי אַ מיליאָן מאל.דער פּרינציפּ איז אונטער די קאַטאַליסיס פון דנאַ פּאָלימעראַסע, ניצן פאָטער שנירל דנאַ ווי אַ מוסטער און ספּעציפיש אָנפאַנגער ווי די סטאַרטינג פונט פֿאַר פאַרלענגערונג.עס איז רעפּליקייטיד אין וויטראָ דורך סטעפּס אַזאַ ווי דינאַטוראַטיאָן, אַנילינג און פאַרלענגערונג.דער פּראָצעס פון טאָכטער שנירל דנאַ קאַמפּלאַמענטשי צו די פאָטער שנירל מוסטער דנאַ.

דער נאָרמאַל פּקר פּראָצעס איז צעטיילט אין דרייַ סטעפּס:

1.דענאַטוראַטיאָן: ניצן הויך טעמפּעראַטור צו באַזונדער דנאַ טאָפּל סטראַנדז.די הידראָגען בונד צווישן דנאַ טאָפּל סטראַנדז איז צעבראכן אין הויך טעמפּעראַטור (93-98 ℃).

2.אַננעאַלינג: נאָך די טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ איז אפגעשיידט, נידעריקער די טעמפּעראַטור אַזוי אַז די אָנפאַנגער קענען בינדן צו די איין-סטראַנדיד דנאַ.

3. עקסטענסיאָן: די דנאַ פּאָלימעראַסע סטאַרץ צו סינטאַסייז קאַמפּלאַמענטשי סטראַנדז צוזאמען די דנאַ סטראַנדז פון די פּרימערז געבונדן ווען די טעמפּעראַטור איז לאָוערד.ווען די פאַרלענגערונג איז געענדיקט, אַ ציקל איז געענדיקט, און די נומער פון דנאַ פראַגמאַנץ דאַבאַלז

ריסיפּראָקייטינג די דריי סטעפּס 25-35 מאל, די נומער פון דנאַ פראַגמאַנץ וועט פאַרגרעסערן עקספּאָונענשאַלי.

די ינדזשאַנואַטי פון PCR איז אַז פאַרשידענע אָנפאַנגערס קענען זיין דיזיינד פֿאַר פאַרשידענע ציל גענעס, אַזוי אַז ציל דזשין פראַגמאַנץ קענען זיין אַמפּלאַפייד אין אַ קורץ צייט.

ביז איצט, פּקר קענען זיין צעטיילט אין דרייַ קאַטעגאָריעס, ניימלי פּראָסט פּקר, פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר און דיגיטאַל פּקר.

דער ערשטער דור פון פּראָסט פּקר

ניצן אַ פּראָסט פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן קיילע צו אַמפּלאַפיי די ציל דזשין, און דעמאָלט נוצן אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס צו דעטעקט די פּראָדוקט, בלויז קוואַליטאַטיווע אַנאַליסיס קענען זיין דורכגעקאָכט.

די הויפּט דיסאַדוואַנטידזשיז פון דער ערשטער דור פּקר:

1.פּראָנע צו ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן און פאַלש positive רעזולטאַטן.

2. די דיטעקשאַן נעמט אַ לאַנג צייַט און די אָפּעראַציע איז קאַמבערסאַם.

3. בלויז קוואַליטאַטיווע פּרובירן קענען זיין געטאן

צווייטע דור רעאַל-צייט פּקר

פאַקטיש-צייט פּקר, אויך באקאנט ווי qPCR, ניצט פלורעסאַנט פּראָבעס וואָס קענען אָנווייַזן די פּראָגרעס פון די אָפּרוף סיסטעם, און מאָניטאָרס די אַקיומיאַליישאַן פון אַמפּלאַפייד פּראָדוקטן דורך די אַקיומיאַליישאַן פון פלורעסאַנט סיגנאַלז, און ריכטער די רעזולטאַטן דורך די פלואָרעססענסע ויסבייג.עס קענען זיין קוואַנטאַפייד מיט די הילף פון Cq ווערט און נאָרמאַל ויסבייג.

ווייַל די qPCR טעכנאָלאָגיע איז געפירט אויס אין אַ פארמאכט סיסטעם, די מאַשמאָעס פון קאַנטאַמאַניישאַן איז רידוסט, און די פלורעסאַנס סיגנאַל קענען זיין מאָניטאָרעד פֿאַר קוואַנטיטאַטיווע דיטעקשאַן, אַזוי עס איז די מערסט וויידלי געניצט אין קליניש פיר און איז געווארן די דאָמינאַנט טעכנאָלאָגיע אין פּקר.

די פלורעסאַנט סאַבסטאַנסיז געניצט אין פאַקטיש-צייט פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר קענען זיין צעטיילט אין: TaqMan פלורעסאַנט זאָנד, מאָלעקולאַר ביקאַנז און פלורעסאַנט פאַרב.

1) TaqMan פלורעסאַנט זאָנד:

בעשאַס פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן, אַ ספּעציפיש פלורעסאַנט זאָנד איז מוסיף בשעת אַ פּאָר פון אָנפאַנגער.די זאָנד איז אַן אָליגאָנוקלעאָטידע, און ביידע ענדס זענען לייבאַלד מיט אַ רעפּאָרטער פלורעסאַנט גרופּע און אַ קווענטשער פלורעסאַנט גרופּע.

ווען די זאָנד איז בעשאָלעם, די פלורעסאַנט סיגנאַל ימיטיד דורך די רעפּאָרטער גרופּע איז אַבזאָרבד דורך די קווענטשינג גרופּע;בעשאַס פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן, די 5′-3′ עקסאָנוקלעאַסע טעטיקייט פון טאַק ענזיים קלעאַווז און דיגרייד די זאָנד, מאכן די רעפּאָרטער פלורעסאַנט גרופּע און קווענטשער די פלורעסאַנט גרופּע איז אפגעשיידט, אַזוי אַז די פלואָרעססענסע מאָניטאָרינג סיסטעם קענען באַקומען די פלואָרעססענסע סיגנאַל, דאָס הייסט, יעדער מאָל ווען אַ פלואָרעסענט פון דנאַ איז אַקיומיאַלייטיד פֿאַר פלואָרעסענט און פלואָרעסענט סענסע סיגנאַל איז גאָר סינגקראַנייזד מיט די פאָרמירונג פון די פּקר פּראָדוקט.

2) SYBR פלורעסאַנט פאַרב:

אין די פּקר אָפּרוף סיסטעם, אַ וידעפדיק פון SYBR פלורעסאַנט פאַרב איז צוגעגעבן.נאָך די SYBR פלורעסאַנט פאַרב איז ניט-ספּעציפיש ינקאָרפּערייטיד אין די דנאַ טאָפּל-שנירל, עס עמיץ אַ פלורעסאַנט סיגנאַל.די SYBR פאַרב מאַלאַקיול וואָס איז נישט ינקאָרפּערייטיד אין די קייט וועט נישט אַרויסלאָזן קיין פלורעסאַנט סיגנאַל, דערמיט ינשורינג די פלורעסאַנט סיגנאַל די פאַרגרעסערן אין פּקר פּראָדוקטן איז גאָר סינגקראַנייזד מיט די פאַרגרעסערן אין פּקר פּראָדוקטן.SYBR בלויז ביינדז צו טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ, אַזוי די מעלטינג ויסבייג קענען זיין געניצט צו באַשליסן צי די פּקר אָפּרוף איז ספּעציפיש.

3) מאָלעקולאַר ביקאַן:

עס איז אַ סטעם-שלייף טאָפּל-לייבאַלד אָליגאָנוקלעאָטידע זאָנד וואָס פארמען אַ האָרפּין סטרוקטור פון וועגן 8 באַסעס אין די 5 און 3 ענדס.די נוקלעיק זויער סיקוואַנסיז אין ביידע ענדס זענען קאַמפּלאַמענטשי פּערד, קאָזינג די פלורעסאַנט גרופּע און די קווענטשינג גרופּע צו זיין ענג.נאָענט, קיין פלורעסאַנס וועט זיין געשאפן.

נאָך די פּקר פּראָדוקט איז דזשענערייטאַד, בעשאַס די אַנילינג פּראָצעס, די מיטל טייל פון די מאָלעקולאַר ביקאַן איז פּערד מיט אַ ספּעציפיש דנאַ סיקוואַנס, און די פלורעסאַנט דזשין איז אפגעשיידט פון די קווענטשער דזשין צו פּראָדוצירן פלורעסאַנס.

די הויפּט דיסאַדוואַנטידזשיז פון צווייטע דור PCR:

סענסיטיוויטי איז נאָך פעלנדיק, און די דיטעקשאַן פון נידעריק-קאָפּיע ספּעסאַמאַנז איז ומפּינקטלעך.

עס איז די השפּעה פון די הינטערגרונט ווערט, און דער רעזולטאַט איז סאַסעפּטאַבאַל צו ינטערפיראַנס.

ווען עס זענען פּקר ינכיבאַטערז אין די אָפּרוף סיסטעם, די דיטעקשאַן רעזולטאַטן זענען סאַסעפּטאַבאַל צו ינטערפיראַנס.

דריט דור דיגיטאַל פּקר

דיגיטאַל פּקר (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) קאַלקיאַלייץ די קאָפּיע נומער פון די ציל סיקוואַנס דורך סוף-פונט דיטעקשאַן, און קענען דורכפירן פּינטלעך אַבסאָלוט קוואַנטיטאַטיווע דיטעקשאַן אָן ניצן ינערלעך קאָנטראָלס און נאָרמאַל קורוועס.

דיגיטאַל פּקר ניצט סוף-פונט דיטעקשאַן און איז נישט אָפענגען אויף די Ct ווערט (ציקל שוועל), אַזוי די דיגיטאַל פּקר אָפּרוף איז ווייניקער אַפעקטאַד דורך די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט, און די טאָלעראַנץ צו פּקר אָפּרוף ינכיבאַטערז איז ימפּרוווד מיט הויך אַקיעראַסי און רעפּראָדוסיביליטי.

רעכט צו דער קעראַקטעריסטיקס פון הויך סענסיטיוויטי און הויך אַקיעראַסי, עס איז נישט לייכט ינערפירד דורך פּקר אָפּרוף ינכיבאַטערז, און עס קענען דערגרייכן אמת אַבסאָלוט קוואַנטיפיקאַטיאָן אָן נאָרמאַל פּראָדוקטן, וואָס איז געווארן אַ פאָרשונג און אַפּלאַקיישאַן האָצפּאָט.

לויט די פאַרשידענע פארמען פון די אָפּרוף אַפּאַראַט, עס קענען זיין צעטיילט אין דרייַ הויפּט טייפּס: מיקראָפלוידיק, שפּאָן און דראַפּלאַט סיסטעמען.

1) מיקראָפלוידיק דיגיטאַל פּקר, מדפּקר:

באַזירט אויף די מיקראָפלוידיק טעכנאָלאָגיע, די דנאַ מוסטער איז אפגעשיידט.די מיקראָפלוידיק טעכנאָלאָגיע קענען פאַרשטיין די מוסטער נאַנאָ-אַפּגריידינג אָדער די דור פון קלענערער דראַפּלאַץ, אָבער די דראַפּלאַץ דאַרפֿן אַ ספּעציעל אַדסאָרפּטיאָן אופֿן און דעמאָלט קאַמביינד מיט די פּקר אָפּרוף סיסטעם.mdPCR איז ביסלעכווייַז אנגענומען דורך אנדערע מעטהאָדס פאַרבייַטן.

2) דראָפּלעט-באזירט דיגיטאַל פּקר, ddPCR:

ניצן וואַסער-אין-אויל דראַפּלאַץ דור טעכנאָלאָגיע צו פּראַסעסינג די מוסטער אין דראַפּלאַץ, און טיילן די אָפּרוף סיסטעם מיט נוקלעיק זויער מאַלאַקיולז אין טויזנטער פון נאַנאָסקאַלע דראַפּלאַץ, יעדער פון וואָס טוט נישט אַנטהאַלטן די נוקלעיק זויער ציל מאַלאַקיולז צו זיין דיטעקטאַד, אָדער כּולל איין צו עטלעכע נוקלעיק זויער ציל מאַלאַקיולז צו זיין טעסטעד.

3) שפּאָן-באזירט דיגיטאַל פּקר, cdPCR:

ניצן די ינאַגרייטיד פליסיק פּאַטוויי טעכנאָלאָגיע צו ינגרייווד פילע מיקראָטובעס און מיקראָקאַוואַטיז אויף סיליציום ווייפערז אָדער קוואַרץ גלאז, און קאָנטראָלירן די לויפן פון די לייזונג דורך פאַרשידענע קאָנטראָל וואַלווז, און טיילן די מוסטער פליסיק אין נאַנאָמעטערס פון דער זעלביקער גרייס אין די אָפּרוף וועלז פֿאַר דיגיטאַל פּקר רעאַקטיאָן צו דערגרייכן אַבסאָלוט קוואַנטיפיקאַטיאָן.

די הויפּט דיסאַדוואַנטידזשיז פון די דריט דור פּקר:

די ויסריכט און רייידזשאַנץ זענען טייַער.

דער מוסטער קוואַליטעט באדערפענישן זענען הויך.אויב די מוסטער קוואַנטיטי יקסידז די מיקראָסיסטעם קוואַנטיטי, עס וועט זיין אוממעגלעך צו קוואַנטיפיצירן, און אויב עס איז צו קליין, די קוואַנטאַפאַקיישאַן אַקיעראַסי וועט זיין רידוסט.

פאַלש פּאַזאַטיווז קענען אויך זיין דזשענערייטאַד ווען עס איז ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.