RT-qPCR איז דער יקערדיק עקספּערימענט פון מאָלעקולאַר ביאָלאָגי, און אַלעמען מוזן זיין באַקאַנט מיט אים.דער הויפּט כולל דריי סטעפּס: רנאַ יקסטראַקשאַן, פאַרקערט טראַנסקריפּציע אין קדנאַ און פאַקטיש-צייט פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר.ס'העלפט נישט, וואס גייט פאר?עס איז מסתּמא אַז עס איז אַ פּראָבלעם מיטדער פאַרקערט טראַנסקריפּציע עקספּערימענט!כאָטש עס מיינט אַז דער פאַרקערט טראַנסקריפּציע עקספּערימענט בלויז דאַרף צו לייגן רנאַ, דנטפּ, אָנפאַנגערס, אוןפאַרקערט טראַנסקריפּציעצו די סענטריפודזש רער און מישן געזונט, אָבער אין די פאַקטיש אָפּעראַציע פּראָצעס, עס זענען נאָך פילע דעטאַילס צו באַצאָלן ופמערקזאַמקייַט.זאל ס לערנען וועגן אים!

ווי צו ריכטער די קוואַליטעט פון רנאַ?
צו קריגן cDNA, די קוואַליטעט פון רנאַ איז קריטיש!רנאַ קוואַליטעט קענען זיין דיטעקטאַד דער הויפּט פֿון צוויי אַספּעקץ:
(1) רנאַ אָרנטלעכקייַט:רנאַ אָרנטלעכקייַט קענען זיין וועראַפייד דורך אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס. גענומען עוקאַריאָטעס ווי אַ בייַשפּיל, די גאַנץ גאַנץ רנאַ האט דרייַ קלאָר באַנדס, די מאָלעקולאַר ווייץ פון גרויס צו קליין זענען 28S, 18S, און 5S, און 28S איז צוויי מאָל ווי ליכטיק ווי 18S;אויב דריי באַנדס קענען זיין געזען, אָבער די באַנד טיפּ איז בלערד אָדער דיפיוזשאַן מיטל אַז די רנאַ איז טייל דיגריידיד.אין דעם צייט, ביטע דורכפירן די פאַרקערט טראַנסקריפּציע אָפּרוף גלייך און פאַרגרעסערן די מוסטער אַרייַנשרייַב אַפּראָופּרייטלי;אויב נאָר אַ באַנדע מיט אַ קליין מאָלעקולאַר וואָג אָדער קיין באַנד קענען זיין געזען, די רנאַ איז גאָר דיגריידיד און דאַרף זיין רייקסטראַקטיד.Agilent 2100 ינדיקייץ די אָרנטלעכקייַט פון רנאַ מיט שפּיץ דיאַגראַמע און רין ווערט.אויב די נוקלעיק זויער איז בעשאָלעם, די באַסעלינע פון ​​די עלעקטראָפעראָגראַם איז פלאַך;אויב די נוקלעיק זויער איז סאַווירלי דיגריידיד, די באַסעלינע איז אַניוואַן און מער דערנידעריקונג פּיקס דערשייַנען;די ווערט פון RIN ריפלעקס די אָרנטלעכקייַט פון די רנאַ, אין די קייט פון 0-10, די גרעסערע די ווערט, די בעסער די קוואַליטעט פון די רנאַ.נו, די העכער די גראַד פון קאַמפּליטנאַס.
(2) ריינקייַט פון רנאַ:די פאַרהעלטעניש פון OD260/280 קענען זיין דיטעקטאַד דורך UV ספּעקטראָפאָטאָמעטרי.אויב די פאַרהעלטעניש פון OD260/280 איז צווישן 1.9 און 2.1, די ריינקייַט איז זייער גוט.
ריזידזשואַל גענאָמיק דנאַ קענען פירן צו ומפּינקטלעך קוואַנטיטאַטיווע רעזולטאַטן
ווען רנאַ איז יקסטראַקטיד, די רנאַ מיר באַקומען קען זיין געמישט מיט גענאָמיק דנאַ (גדנאַ) וואָס איז נישט קלינד.דעריבער, די cDNA נאָך פאַרקערט טראַנסקריפּציע וועט אויך זיין געמישט מיטגדנאַ.בעשאַס די דאַונסטריםqPCRרעאקציע,cDNAאון גדנאַ קען זיין אַמפּלאַפייד סיימאַלטייניאַסלי, ריזאַלטינג אין אַ לעפיערעך קליין קאָרט ווערט, אַזוי די רעזולטאַטן קען זיין בייאַסט.
אַזוי וואָס זאָל מיר טאָן אין דעם סיטואַציע?פאָרעגענעפֿאָרשלאָגן:
(1) דורכפירן גענאָמע רייניקונג אויף די ריווערסט רנאַ, וואָס קענען זיין אַוועקגענומען דורך זייַל יקסטראַקשאַן בעשאַס רנאַ יקסטראַקשאַן;
(2) מייַכל די יקסטראַקטיד רנאַ מיט דנאַסעI , אָבער פאַרענדיקן עס מיט עדטאַ;
פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע רייידזשאַנץמיט גענאָמע פּאָליאַנע מאַדזשולז;

ווי צו קלייַבן פּרימערז פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע?
פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּרימערז אויך אַפעקץ די אַוטקאַם פון די פאַרקערט טראַנסקריפּציע אָפּרוף.איר קענען קלייַבן ראַנדאָם פּרימערז, Oligo dT אָדער דזשין-ספּעציפיש אָנפאַנגער פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע לויט די ספּעציפיש צושטאנדן פון דער עקספּערימענט:
(1) ספּעציפיש טראַנסקריפּץ: דזשין-ספּעציפיש פּרימערז זענען רעקאַמענדיד;
(2) לאַנגע פראַגמענט טראַנסקריפּץ: Oligo dT / דזשין-ספּעציפיש פּרימערז זענען רעקאַמענדיד;
(3) ינערלעך פראַגמאַנץ פון לאַנג-אָפּשניט טראַנסקריפּץ: דזשין-ספּעציפיש אָנפאַנגער / טראַפ - אָנפאַנגער / טראַפ - אָנפאַנגער + אָליגאָ דט.אויב די סאַבסאַקוואַנט qPCR עקספּערימענט איז דורכגעקאָכט, Oligo dT קענען ניט זיין געוויינט אַליין, ווייַל ניצן Oligo dT אַליין קען פאַרשאַפן 3′ סוף פאָרורטייל, לידינג צו ומפּינקטלעך qPCR עקספּערימענט רעזולטאַטן;
(4) מירנאַ: סטעם-שלייף אָנפאַנגער אָדער טיילינג אָנפאַנגער קענען זיין געוויינט.

ווי פילע מאָל זאָל די פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּראָדוקט cDNA זיין דיילוטאַד פֿאַר קוואַנטאַפאַקיישאַן?
נאָך באקומען די cDNA פון די פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּראָדוקט, ווי פילע מאָל די cDNA זאָל זיין דיילוטאַד פֿאַר qPCR יקספּעראַמאַנץ איז זייער וויכטיק.אויב די cDNA קאַנסאַנטריישאַן איז צו הויך אָדער צו נידעריק, די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט קען זיין אַפעקטאַד.קענען די cDNA קאַנסאַנטריישאַן זיין געמאסטן, און ווי זאָל עס זיין געטאן?
(1) די cDNA קאַנסאַנטריישאַן פון די פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּראָדוקט קענען ניט זיין געמאסטן, ווייַל אין אַדישאַן צו די cDNA פּראָדוקט, די פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּראָדוקט אויך כּולל פאַרקערט טראַנסקריפּציע ריזידזשואַל באַפער, פאַרקערט טראַנסקריפּציע, אָנפאַנגערס, אאז"ו ו, וואָס וועט אַרייַנמישנ זיך מיט די קאַנסאַנטריישאַן מעזשערמאַנט רעזולטאַטן און פאַרשאַפן OD260/280, OD260 / 260 ניט אמת פאַרהעלטעניש און 260 / 260 איז נישט אמת.אין דער צייט, וועלן עטלעכע פריינט זאָגן, דעמאָלט איך וועט מעסטן די קאַנסאַנטריישאַן נאָך רייניקונג;דאָ, Foregene וואָלט ווי צו דערמאָנען אַז די קדנאַ איז נישט רעקאַמענדיד צו זיין פּיוראַפייד, ווייַל די לענג פון די קדנאַ באקומען דורך די מאַפּאָלע איז אַנדערש, און די קורץ קדנאַ וועט זיין פאַרפאַלן אין די רייניקונג.
(2) אַזוי וואָס צו טאָן?איידער די qPCR עקספּערימענט, די דיילושאַן גראַדיענט פון די cDNA קענען זיין באשלאסן דורך די פאַר-עקספּערימענט.פֿאַר בייַשפּיל: נוצן cDNA לאַגער לייזונג, 10-פאַרלייגן דיילושאַן און 100-פאַרלייגן דיילושאַן ווי טעמפּלאַטעס פֿאַר qPCR יקספּעראַמאַנץ, און אויסקלייַבן די דיילושאַן פאַקטאָר מיט אַ קאָרט ווערט אין די קייט פון 18-28.

ווי זאָל מירנאַס זיין פאַרקערט טראַנסקריבעד?
מירנאַ איז אַ איין-סטראַנדיד קליין מאַלאַקיול רנאַ מיט אַ גרייס פון וועגן 22 נט וואָס טוט נישט קאָד פֿאַר פּראָטעין.ווייַל פון זייַן קורץ לענג, די קאַנווענשאַנאַל קפּקר אופֿן איז שווער צו קוואַנטיפיקירן עס גלייַך, אַזוי עס איז אָפט נייטיק צו פאַרברייטערן מירנאַ;די קאַמאַנלי געוויינט פאַרקערט טראַנסקריפּציע מעטהאָדס פֿאַר מירנאַ אַרייַננעמען סטעם-שלייף אופֿן און טיילינג אופֿן.
די סטעם-שלייף אופֿן איז צו פאַרברייטערן די מירנאַ דורך אַדינג סטעם-שלייף פּרימערז.דעם דיטעקשאַן אופֿן האט העכער סענסיטיוויטי און ספּעסיפיקאַטי, אָבער די דיטעקשאַן טרופּוט איז נידעריק.איין פאַרקערט טראַנסקריפּציע קענען בלויז דעטעקט איין מירנאַ און אַן ינערלעך רעפֿערענץ;דער עק-אַדינג אופֿן איז קאַמפּאָוזד פון צוויי עס איז געענדיקט דורך די שלאָס קאַמף פון צוויי ענזימעס, וואָס זענען פּאָליאַ פּאָלימעראַסע און פאַרקערט טראַנסקריפּציע.פּאָליאַ פּאָלימעראַסע איז פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר אַדינג פּאָליאַ עקן צו מירנאַ צו פאַרגרעסערן זייַן לענג, און פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּערפאָרמז אַ פאַרקערט טראַנסקריפּציע אָפּרוף.דער אופֿן האט אַ הויך דיטעקשאַן טרופּוט און קענען דעטעקט קייפל מירנאַס און ינערלעך באַווייַזן אין איין פאַרקערט טראַנסקריפּציע, אָבער די סענסיטיוויטי און ספּעציפֿישקייט זענען נידעריק אין די סטעם-שלייף אופֿן.