פּקר איז די מערסט וויידלי געניצט נוקלעיק זויער אַמפּלאַפאַקיישאַן טעכנאָלאָגיע און איז וויידלי געניצט רעכט צו זייַן סענסיטיוויטי און ספּעסיפיסיטי.אָבער, PCR ריקווייערז ריפּיטיד טערמאַל דינאַטוראַטיאָן און קענען נישט באַקומען באַפרייַען פון די לימיטיישאַנז פון רילייינג אויף ינסטראַמאַנץ און ויסריכט, וואָס לימאַץ זייַן אַפּלאַקיישאַן אין קליניש פעלד טעסטינג.

זינט די פרי 1990 ס, פילע לאַבאָראַטאָריעס האָבן אנגעהויבן צו אַנטוויקלען קעסיידערדיק טעמפּעראַטור אַמפּלאַפאַקיישאַן טעכנאָלאָגיע וואָס טוט נישט דאַרפן טערמאַל דינאַטוריישאַן.איצט זיי האָבן דעוועלאָפּעד שלייף-מעדיאַטעד יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן טעכנאָלאָגיע, שנירל פאַרבייַט יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן טעכנאָלאָגיע, ראָולינג קרייַז יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן טעכנאָלאָגיע און נוקלעיק זויער סיקוואַנס אָפענגיקייַט.יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן טעכנאָלאָגיע און אנדערע טעקנאַלאַדזשיז. 

Lאָופּ-מעדיאַטעד יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן

דער אַמפּלאַפאַקיישאַן פּרינציפּ איז באזירט אויף דעם פאַקט אַז דנאַ איז אין אַ דינאַמיש יקוואַליבריאַם שטאַט ביי וועגן 65 ° C.ווען קיין אָנפאַנגער איז באַזע-פּערד און עקסטענדעד צו די קאַמפּלאַמענטשי טייל פון טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ, די אנדערע שנירל וועט דיססאָסיאַטע און ווערן איין-סטראַנדיד.

אין דעם טעמפּעראַטור, דנאַ ניצט 4 ספּעציפיש אָנפאַנגערס צו פאַרלאָזנ זיך אַ סטראַנד-דיפּלייסמאַנט דנאַ פּאָלימעראַסע צו מאַכן די סינטעז פון שנירל-דיפּלייסמאַנט דנאַ זיך-סירקולירן קאַנטיניואַסלי.

ערשטער באַשטימען די 6 ספּעציפיש מקומות F3, F2, F1, B1, B2, B3 אויף די ציל דזשין, און דעמאָלט פּלאַן 4 פּרימערז באזירט אויף די 6 ספּעציפיש מקומות (ווי געוויזן אין די פיגור אונטן):

די פאָרויס ינער אָנפאַנגער (FIP) איז קאַמפּאָוזד פון F1c און F2.

די צוריק ינער אָנפאַנגער (BIP) איז קאַמפּאָוזד פון B1c און B2, און TTTT איז געניצט ווי אַ ספּייסער אין די מיטל.

די ויסווייניקסט פּרימערז F3 און B3 זענען ריספּעקטיוולי קאַמפּאָוזד פון F3 און B3 מקומות אויף די ציל דזשין.

אין די LAMP אָפּרוף סיסטעם, די קאַנסאַנטריישאַן פון די ינער אָנפאַנגער איז עטלעכע מאָל אַז פון די ויסווייניקסט אָנפאַנגער.די ינער אָנפאַנגער איז ערשטער קאַמביינד מיט די מוסטער שנירל צו סינטאַסייז אַ קאַמפּלאַמענטשי שנירל צו פאָרעם אַ דנאַ טאָפּל שנירל.דערנאָך, די ויסווייניקסט אָנפאַנגער איז קאַמביינד מיט די מוסטער שנירל צו פאָרעם אַ דנאַ טאָפּל שנירל.אונטער דער קאַמף פון BstDNA פּאָלימעראַסע, די קאַמפּלאַמענטשי שנירל סינטאַסייזד דורך די ינער אָנפאַנגער איז באפרייט.נאָך אַ סעריע פון ​​ריאַקשאַנז, די קאַמפּלאַמענטשי שנירל לעסאָף פארמען אַ איין דנאַ שנירל מיט אַ האַנטעל סטרוקטור.

די האַנטעל סטרוקטור דנאַ איין שנירל זיך איז געניצט ווי אַ מוסטער צו קאַנטיניואַסלי פאָרעם אַ טראַנזישאַנאַל סטעם-שלייף סטרוקטור דנאַ מיט אַ עפענען סוף.די ינער און ויסווייניקסט אָנפאַנגערס פירן די טראַנזישאַנאַל סטעם-שלייף סטרוקטור דנאַ צו קאַנטיניואַסלי אַנדערגאָו שנירל דיספּלייסמאַנט און פאַרלענגערונג ריאַקשאַנז, און לעסאָף פאָרעם קייפל סטעם-שלייף סטראַקטשערז מיט פאַרשידענע לענגקטס.דנאַ געמיש.

אַדוואַנטאַגעס און דיסאַדוואַנטידזשיז פון שלייף-מעדיאַטעד יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן

אַדוואַנטאַגעס פון LAMP:

(1) הויך אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט, וואָס קענען יפעקטיוולי פאַרגרעסערן 1-10 עקזעמפלארן פון די ציל דזשין ין 1 שעה, און די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט איז 10-100 מאל אַז פון פּראָסט פּקר.

(2) דער אָפּרוף צייט איז קורץ, די ספּעציפֿישקייט איז שטאַרק, און קיין ספּעציעל עקוויפּמענט איז פארלאנגט.

חסרונות פון LAMP:

(1) די באדערפענישן פֿאַר אָנפאַנגער זענען דער הויפּט הויך.

(2) די אַמפּלאַפייד פּראָדוקט קענען ניט זיין געניצט פֿאַר קלאָונינג און סיקוואַנסינג, אָבער קענען זיין געוויינט בלויז פֿאַר משפט.

(3) רעכט צו זיין שטאַרק סענסיטיוויטי, עס איז גרינג צו פאָרעם אַעראָסאָלס, קאָזינג פאַלש פּאַזאַטיווז און אַפעקטינג די פּרובירן רעזולטאַטן.

Sטראַנד דיספּלייסמאַנט אַמפּלאַפאַקיישאַן

סטראַנד דיספּלייסמאַנט אַמפּלאַפאַקיישאַן (SDA) איז אַן ינ וויטראָ יסאָטהערמאַל דנאַ אַמפּלאַפאַקיישאַן טעכניק באזירט אויף ענזימאַטיק אָפּרוף ערשטער פארגעלייגט דורך אמעריקאנער געלערנטער וואָקער אין 1992.

די גרונט סיסטעם פון SDA כולל אַ ריסטריקשאַן ענדאָנוקלעאַסע, אַ דנאַ פּאָלימעראַסע מיט שנירל דיספּלייסמאַנט טעטיקייט, צוויי פּערז פון פּרימערז, דנטפּס, און קאַלסיום און מאַגניזיאַם ייאַנז און באַפער סיסטעמען.

דער פּרינציפּ פון שטראַל דיספּלייסמאַנט אַמפּלאַפאַקיישאַן איז באזירט אויף די קעמאַקלי מאַדאַפייד ריסטריקשאַן ענדאָנוקלעאַסע דערקענונג סיקוואַנס אין ביידע ענדס פון די ציל דנאַ.די ענדאָנוקלעאַסע עפֿנט די ריס אין די שנירל דנאַ ביי זיין דערקענונג פּלאַץ, און די דנאַ פּאָלימעראַסע יקסטענדז די ריס 3′ סוף און פאַרבייַטן די ווייַטער דנאַ שנירל.

די ריפּלייסט איין סטראַנדז פון דנאַ קענען זיין קאַמביינד מיט פּרימערז און עקסטענדעד אין טאָפּל סטראַנדז דורך דנאַ פּאָלימעראַסע.דעם פּראָצעס איז ריפּיטיד קאַנטיניואַסלי, אַזוי אַז די ציל סיקוואַנס איז יפישאַנטלי אַמפּלאַפייד.

אַדוואַנטאַגעס און דיסאַדוואַנטידזשיז פון סטראַנד דיספּלייסמאַנט אַמפּלאַפאַקיישאַן טעכנאָלאָגיע

אַדוואַנטאַגעס פון SDA:

די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט איז הויך, די אָפּרוף צייט איז קורץ, די ספּעסיפיסיטי איז שטאַרק און קיין ספּעציעל ויסריכט איז פארלאנגט.

חסרונות פון SDA:

די פּראָדוקטן זענען נישט מונדיר, און עטלעכע איין-סטראַנדיד און טאָפּל-סטראַנדיד פּראָדוקטן זענען שטענדיק געשאפן אין די SDA ציקל, און טיילינג וועט ינעוואַטאַבלי פאַלן ווען דיטעקטאַד דורך עלעקטראָפאָרעסיס.

Rאָללינג קרייַז אַמפּלאַפאַקיישאַן

ראָולינג קרייַז אַמפּלאַפאַקיישאַן (RCA) איז פארגעלייגט דורך צייכענונג אויף דעם אופֿן פון קאַפּיינג דנאַ פון פּאַטאַדזשעניק אָרגאַניזאַמז דורך ראָולינג קרייַז.עס רעפערס צו די נוצן פון איין-סטראַנדיד קייַלעכיק דנאַ ווי אַ מוסטער אין אַ קעסיידערדיק טעמפּעראַטור, און אַ ספּעציעל דנאַ פּאָלימעראַסע (אַזאַ ווי פי29) ) אונטער דער קאַמף פון ראָולינג קרייַז דנאַ סינטעז צו דערגרייכן די אַמפּלאַפאַקיישאַן פון די ציל דזשין.

RCA קענען זיין צעטיילט אין לינעאַר אַמפּלאַפאַקיישאַן און עקספּאָונענשאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן.די עפעקטיווקייַט פון לינעאַר RCA קענען דערגרייכן 10⁵מאל, און די עפעקטיווקייַט פון עקספּאָונענשאַל RCA קענען דערגרייכן 10⁹מאל.

פּשוט דיסטינגקשאַן, ווי געוויזן אין די פיגור אונטן, לינעאַר אַמפּלאַפאַקיישאַן אַ בלויז ניצט 1 אָנפאַנגער, עקספּאָונענשאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן ב האט 2 אָנפאַנגער.

לינעאַר RCA איז אויך גערופן איין אָנפאַנגער RCA.א אָנפאַנגער ביינדז צו קייַלעכיק דנאַ און איז עקסטענדעד דורך די קאַמף פון דנאַ פּאָלימעראַסע.דער פּראָדוקט איז אַ לינעאַר איין שנירל מיט אַ גרויס נומער פון ריפּעטיטיוו סיקוואַנסיז טויזנטער פון מאל די לענג פון אַ איין שלייף.

זינט די פּראָדוקט פון לינעאַר RCA איז שטענדיק פארבונדן צו די סטאַרטינג אָנפאַנגער, די גרינג פיקסיישאַן פון די סיגנאַל איז אַ הויפּט מייַלע.

עקספּאָונענשאַל רקאַ, אויך באקאנט ווי היפּער בראַנטשט אַמפּלאַפאַקיישאַן HRCA (היפּער בראַנטשט רקאַ), אין עקספּאָונענשאַל רקאַ, איין אָנפאַנגער אַמפּלאַפיייז די רקאַ פּראָדוקט, דער צווייטער אָנפאַנגער כייברידיזיז מיט די רקאַ פּראָדוקט און יקסטענדז, און די פאַרבייַט איז שוין געבונדן צו די רקאַ פּראָדוקט די דאַונסטרים אָנפאַנגער פאַרברייטערן די שנירל, און איבערחזרן פאַרלענגערונג און פאַרבייַט פּראָדוקט.

די אַדוואַנידזשיז און דיסאַדוואַנטידזשיז פון ראָולינג קרייַז נוקלעיק זויער אַמפּלאַפאַקיישאַן

אַדוואַנטאַגעס פון RCA:

הויך סענסיטיוויטי, גוט ספּעסיפיסיטי און גרינג אָפּעראַציע.

חסרונות פון RCA:

הינטערגרונט פּראָבלעמס בעשאַס סיגנאַל דיטעקשאַן.בעשאַס די RCA אָפּרוף, די ונסערקולאַטעד פּאַדלאָקק זאָנד און די מוסטער דנאַ אָדער רנאַ פון די אַנבאַונד זאָנד קען דזשענערייט עטלעכע הינטערגרונט סיגנאַלז. 

Nוקלעיקאַסיד סיקוואַנס-באזירט אַמפּלאַפאַקיישאַן

נוקלעיק זויער סיקוואַנס-באזירט אַמפּלאַפאַקיישאַן (NASBA) איז אַ נייַע טעכנאָלאָגיע דעוועלאָפּעד אויף דער באזע פון ​​פּקר.עס איז אַ קעסיידערדיק און יסאָטהערמאַל נוקלעיק זויער אַמפּלאַפאַקיישאַן גיידיד דורך אַ פּאָר פון פּרימערז מיט אַ T7 פּראָמאָטער סיקוואַנס.די טעכנאָלאָגיע קענען פאַרגרעסערן די מוסטער רנאַ מיט וועגן 109 מאל אין וועגן 2 שעה, וואָס איז 1000 מאל העכער ווי די קאַנווענשאַנאַל פּקר אופֿן און טוט נישט דאַרפן ספּעציעל ויסריכט.

די טעכנאָלאָגיע איז געניצט פֿאַר גיך דיאַגנאָסיס פון חולאתן ווי באַלד ווי עס ארויס, און פילע קאָמפּאַניעס דערווייַל נוצן דעם אופֿן אין רנאַ דיטעקשאַן קיץ.

כאָטש רנאַ אַמפּלאַפאַקיישאַן קענען אויך נוצן פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּקר טעכנאָלאָגיע, NASBA האט זיין אייגענע אַדוואַנטידזשיז: עס קענען זיין דורכגעקאָכט אונטער לעפיערעך קעסיידערדיק טעמפּעראַטור טנאָים, און עס איז מער סטאַביל און פּינטלעך ווי טראדיציאנעלן פּקר טעכנאָלאָגיע.

דער אָפּרוף איז ביי 41 דיגריז סעלסיוס און ריקווייערז AMV (אַוויאַן מיעלאָבלאַסטאָסיס ווירוס) פאַרקערט טראַנסקריפּציע, רנאַסע ה, ט7 רנאַ פּאָלימעראַסע און אַ פּאָר פון אָנפאַנגער צו פאַרענדיקן.

דער פּראָצעס דער הויפּט כולל:

דער פאָרויס אָנפאַנגער כּולל די קאַמפּלאַמענטשי סיקוואַנס פון די T7 פּראָמאָטער.בעשאַס דער אָפּרוף, די פאָרויס אָנפאַנגער ביינדז צו די רנאַ שנירל און איז קאַטאַלייזד דורך די AMV ענזיים צו פאָרעם אַ דנאַ-רנאַ טאָפּל שנירל.

רנאַסע ה דיידזשעסטיד די רנאַ אין די כייבריד טאָפּל-שנירל און ריטיין די איין-סטראַנדיד דנאַ.

אונטער דער קאַמף פון די פאַרקערט אָנפאַנגער און די AMV ענזיים, אַ דנאַ טאָפּל שנירל מיט די T7 פּראָמאָטער סיקוואַנס איז געשאפן.

אונטער דער קאַמף פון T7 רנאַ פּאָלימעראַסע, די טראַנסקריפּציע פּראָצעס איז געענדיקט און אַ גרויס סומע פון ​​ציל רנאַ איז געשאפן.

אַדוואַנטאַגעס פון NASBA:

(1) זיין אָנפאַנגער האט אַ T7 פּראָמאָטער סיקוואַנס, אָבער די פרעמד טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ האט קיין T7 פּראָמאָטער סיקוואַנס און קענען ניט זיין אַמפּלאַפייד, אַזוי די טעכנאָלאָגיע האט הויך ספּעסיפיקאַטי און סענסיטיוויטי.

(2) NASBA ינקאָרפּערייץ גלייַך די פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּראָצעס אין די אַמפּלאַפאַקיישאַן אָפּרוף, פאַרקירצן די אָפּרוף צייט.

דיסאַדוואַנטידזשיז פון NASBA:

(1) די אָפּרוף קאַמפּאָונאַנץ זענען מער קאָמפּליצירט.

(2) דריי מינים פון ענזימעס זענען פארלאנגט צו מאַכן די אָפּרוף קאָס העכער.