פאַקטיש צייט פּקר, אויך באקאנט ווי קוואַנטיטאַטיווע פּקר אָדער קפּקר, איז אַ מעטאָד פֿאַר פאַקטיש-צייט מאָניטאָרינג און אַנאַליסיס פון פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן.
ווייַל קוואַנטיטאַטיווע פּקר האט די אַדוואַנטידזשיז פון פּשוט אָפּעראַציע, שנעל און באַקוועם, הויך סענסיטיוויטי, גוט ריפּיטאַביליטי און נידעריק קאַנטאַמאַניישאַן קורס, עס איז וויידלי געניצט אין מעדיציניש טעסטינג, מעדיצין עפיקאַסי אַססעססמענט, דזשין אויסדרוק פאָרשונג, טראַנסגעניק פאָרשונג, דזשין דיטעקשאַן, פּאַטאַדזשאַן דיטעקשאַן, כייַע און פאַבריק דיטעקשאַן., עסנוואַרג טעסטינג און אנדערע פעלדער.
דעריבער, צי איר זענט פאַרקנאַסט אין יקערדיק פאָרשונג אין לעבן ססיענסעס, אָדער עמפּלוייז פון פאַרמאַסוטיקאַל קאָמפּאַניעס, כייַע כאַזבאַנדרי קאָמפּאַניעס, עסנוואַרג קאָמפּאַניעס, אָדער אפילו עמפּלוייז פון אַרייַנגאַנג-אַרויסגאַנג דורכקוק און קאַראַנטין ביוראָוז, ינווייראַנמענאַל מאָניטאָרינג דיפּאַרטמאַנץ, האָספּיטאַלס ​​​​און אנדערע וניץ, איר וועט זיין מער אָדער ווייניקער יקספּאָוזד צו אָדער איר דאַרפֿן צו וויסן די וויסן פון מאַסטערינג קוואַנטיטאַטיווע פּקר.

פּרינציפּ פון פאַקטיש צייט פּקר

פאַקטיש צייט פּקר איז אַ מעטאָד אין וואָס פלורעסאַנט סאַבסטאַנסיז זענען מוסיף צו די פּקר אָפּרוף סיסטעם, און די פלואָרעססענסע סיגנאַל ינטענסיטי אין דעם פּראָצעס פון פּקר אָפּרוף איז מאָניטאָרעד אין פאַקטיש צייט דורך אַ קוואַנטיטאַטיווע פּקר קיילע, און לעסאָף די יקספּערמענאַל דאַטן זענען אַנאַלייזד און פּראַסעסט.

【אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג】איז די ויסבייג דיסקרייבינג די דינאַמיש פּראָצעס פון פּקר.די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג פון פּקר איז נישט אַ נאָרמאַל עקספּאָונענשאַל ויסבייג, אָבער אַ סיגמאָיד ויסבייג.

[פּלאַטפאָרם פאַסע פון ​​אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג]מיט די פאַרגרעסערן פון די נומער פון פּקר סייקאַלז, די ינאַקטיוויישאַן פון דנאַ פּאָלימעראַסע, די דיפּלישאַן פון דנטפּס און אָנפאַנגערס, און די ינאַבישאַן פון די סינטעז אָפּרוף דורך די רעאַקציע ביי-פּראָדוקט פּיראָפאָספאַטע, אאז"ו ו, די פּקר איז ניט שטענדיק יקספּאַנדיד עקספּאָונענשאַלי., און יווענטשאַוואַלי אַרייַן אַ פּלאַטאָ.

[עקספּאָונענטיאַל גראָוט געגנט פון אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג]כאָטש די פּלאַטאָ פאַסע וועריז זייער, אין אַ זיכער געגנט פון די עקספּאָונענשאַל וווּקס געגנט פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג, די ריפּיטאַביליטי איז זייער גוט, וואָס איז זייער וויכטיק פֿאַר קוואַנטיטאַטיווע אַנאַליסיס פון פּקר.

[שוועל ווערט און Ct ווערט]מיר שטעלן די שיעור ווערט פון פלואָרעססענסע דיטעקשאַן אין די צונעמען שטעלע אין די עקספּאָונענשאַל וווּקס געגנט פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג, ניימלי די שוועל ווערט (טהרעשאָלד).די ינטערסעקשאַן פון די שוועל ווערט און די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג איז די Ct ווערט, דאָס איז, די Ct ווערט רעפערס צו די נומער פון סייקאַלז (Threshold Cycle) ווען די שוועל ווערט איז ריטשט.

די גראַפיק אונטן קלאר ווייזט די שייכות צווישן שוועל שורה און אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג, שוועל און Ct ווערט.

【ווי צו קוואַנטיפיקירן?】

עס איז פּרוווד דורך מאַטאַמאַטיקאַל טעאָריע אַז די Ct ווערט האט אַ פאַרקערט לינעאַר שייכות מיט די לאָגאַריטהם פון די נומער פון ערשט טעמפּלאַטעס.פאַקטיש צייט PCR מאָניטאָרס PCR אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן אין פאַקטיש צייט און קוואַנטאַפייז זיי בעשאַס די עקספּאָונענשאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן פאַסע.

פֿאַר יעדער ציקל פון פּקר, די דנאַ געוואקסן עקספּאָונענשאַלי דורך 2 מאל, און באַלד ריטשט אַ פּלאַטאָ.

אַסומינג אַז די סומע פון ​​סטאַרטינג דנאַ איז א₀ נאָך n סייקאַלז, די טעאָרעטיש סומע פון ​​דנאַ פּראָדוקט קענען זיין אויסגעדריקט ווי:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

דערנאָך, די מער די ערשט דנאַ סומע א 0 איז, די גיכער די סומע פון ​​​​די אַמפּלאַפייד פּראָדוקט ריטשאַז די דיטעקשאַן ווערט An, און די נומער פון סייקאַלז ווען ריטשינג אַן איז די Ct ווערט.אַז איז, די מער די ערשט דנאַ סומע א 0 איז, די פריער די אַמפּלאַפאַקיישאַן ויסבייג פּיקס, און די קאָראַספּאַנדינגלי די פארלאנגט נומער פון סייקאַלז n איז קלענערער.

מיר דורכפירן גראַדיענט דיילושאַן פון די סטאַנדאַרט פון באַוווסט קאַנסאַנטריישאַן און נוצן עס ווי אַ מוסטער פֿאַר רעאַל צייט פּקר, און אַ סעריע פון ​​אַמפּלאַפאַקיישאַן קורוועס וועט זיין באקומען אין גלייַך ינטערוואַלז אין די סדר פון סטאַרטינג דנאַ סומע פון ​​מער צו ווייניקער.לויט די לינעאַר שייכות צווישן די Ct ווערט און די לאָגאַריטהם פון די נומער פון סטאַרטינג טעמפּלאַטעס, אַ[נאָרמאַל ויסבייג] קענען זיין באשאפן.

דורך סאַבסטיטוטינג די Ct ווערט פון די מוסטער מיט אומבאַקאַנט קאַנסאַנטריישאַן אין די נאָרמאַל ויסבייג, די ערשט מוסטער סומע פון ​​די מוסטער מיט אומבאַקאַנט קאַנסאַנטריישאַן קענען זיין באקומען, וואָס איז די קוואַנטיטאַטיווע פּרינציפּ פון פאַקטיש צייט פּקר.

דיטעקשאַן אופֿן פון פאַקטיש צייט פּקר

פאַקטיש צייט PCR דיטעקץ PCR אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן דורך דיטעקטינג די פלואָרעססענסע ינטענסיטי אין די אָפּרוף סיסטעם.

פּרינציפּ פון פלורעסאַנט פאַרב עמבעדדינג מעטאַד】

פלורעסאַנט דיעס, אַזאַ ווי טב גרין ®, קענען נאַנספּאַסיפיקלי בינדן צו טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ אין פּקר סיסטעמען און פלואָרעסס אויף ביינדינג.

די פלואָרעססענסע ינטענסיטי אין די אָפּרוף סיסטעם געוואקסן עקספּאָונענשאַלי מיט די פאַרגרעסערן פון פּקר סייקאַלז.דורך דיטעקטינג די פלואָרעססענסע ינטענסיטי, די סומע פון ​​​​דנאַ אַמפּלאַפאַקיישאַן אין די אָפּרוף סיסטעם קענען זיין מאָניטאָרעד אין פאַקטיש צייט, און די סומע פון ​​​​די סטאַרטינג מוסטער אין דער מוסטער קענען זיין ריווערסלי עסטימאַטעד.

【פּרינציפּ פון פלורעסאַנט זאָנד אופֿן】

פלורעסאַנט זאָנדאיז אַ נוקלעיק זויער סיקוואַנס מיט אַ פלורעסאַנט גרופּע אין די 5′ סוף און אַ קווענטשינג גרופּע אין די 3′ סוף, וואָס קענען ספּאַסיפיקלי בינדן צו די מוסטער.ווען די זאָנד איז בעשאָלעם, די פלואָרעססענסע ימיטיד דורך די פלואָראָפאָר איז קווענטשעד דורך די קווענטשינג גרופּע און קענען נישט פלורעסס.ווען די זאָנד איז דיקאַמפּאָוזד, די פלורעסאַנט מאַטעריע וועט דיססאָסיאַטע און אַרויסלאָזן פלורעסאַנס.

א פלורעסאַנט זאָנד איז מוסיף צו די פּקר אָפּרוף לייזונג.בעשאַס די אַנילינג פּראָצעס, די פלורעסאַנט זאָנד וועט בינדן צו די ספּעציפיש שטעלע פון ​​די מוסטער.בעשאַס די פאַרלענגערונג פּראָצעס, די 5′→3′ עקסאָנוקלעאַסע טעטיקייט פון די פּקר ענזיים קענען צעלייגנ די פלורעסאַנט זאָנד כייברידייזד מיט די מוסטער, און די פלורעסאַנט מאַטעריע איז דיססאָסיאַטעד צו אַרויסלאָזן פלורעסאַנס.דורך דיטעקטינג די פלואָרעססענסע ינטענסיטי פון די זאָנד אין די אָפּרוף סיסטעם, דער ציל פון מאָניטאָרינג די אַמפּלאַפאַקיישאַן סומע פון ​​די פּקר פּראָדוקט קענען זיין אַטשיווד.

【סעלעקציע פון ​​פלואָרעססענסע דעטעקשאַן מעטאַד】

אויב עס איז געניצט צו ויסטיילן סיקוואַנסיז מיט הויך האָמאָלאָגי און דורכפירן מולטיפּלעקס פּקר דיטעקשאַן אַזאַ ווי SNP טייפּינג אַנאַליסיס, די פלורעסאַנט זאָנד אופֿן איז יראַפּלייסאַבאַל.
פֿאַר אנדערע פאַקטיש צייט פּקר יקספּעראַמאַנץ, אַ פּשוט, גרינג און נידעריק-פּרייַז פלורעסאַנט טשימעראַ אופֿן קענען זיין געוויינט.

פּראָבעס שטאַרק ספּעציפֿישקייט, טויגעוודיק פון מולטיפּלעקס פּקר

שאָרטקאָמינג

הויך ספּעסיפיקאַטי באדערפענישן פֿאַר אַמפּלאַפאַקיישאַן;

מולטיפּלעקס פּקר קענען ניט זיין געטאן. דאַרפֿן צו פּלאַן ספּעציפיש פּראָבעס, הויך פּרייַז;

מאל זאָנד פּלאַן איז שווער

פֿאַרבונדענע פּראָדוקטן: