אין qPCR יקספּעראַמאַנץ, אָנפאַנגער פּלאַן איז אויך אַ זייער וויכטיק לינק.צי די אָנפאַנגערס זענען פּאַסיק אָדער נישט איז ענג שייַכות צו צי די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט ריטשאַז די סטאַנדאַרט, צי די אַמפּלאַפייד פּראָדוקטן זענען ספּעציפיש, און צי די יקספּערמענאַל רעזולטאַטן זענען בנימצא.
אַזוי ווי צו מאַכן די qPCR אָנפאַנגער ספּעסיפיקאַטי בעסער?הויך אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט?
הייַנט, מיר וועלן נעמען איר צו פּלאַן qPCR אָנפאַנגער צוזאַמען, און לאָזן qPCR אָנפאַנגער פּלאַן ווערן אַן עפעקטיוו לערנען סקילז אין יקספּעראַמאַנץ.
ווען דיזיינינג qPCR אָנפאַנגער, יוזשאַוואַלי אכטונג צו די פאלגענדע פונקטן: אָנפאַנגער זאָל זיין דיזיינד אַריבער ינטראָנז ווי פיל ווי מעגלעך, די פּראָדוקט לענג זאָל זיין 100-300 בפּ, די Tm ווערט זאָל זיין ווי נאָענט ווי מעגלעך צו 60 ° C, און די אַפּסטרים און דאַונסטרים אָנפאַנגער זאָל זיין ווי נאָענט ווי מעגלעך, און די סוף פון די אָנפאַנגער זאָל זיין ג אָדער C, אאז"ו ו.
1. פּלאַן פון פּרימערז ספּאַנינג ינטראָנס
ווען דיזיינינג qPCR אָנפאַנגערס, טשוזינג אָנפאַנגערס דיזיינד אַריבער ינטראָנס קענען פאַרמייַדן די גדנאַ מוסטער פון אַמפּלאַפייד, און די פּראָדוקטן זענען אַלע דערייווד פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן פון cDNA, אַזוי ילימאַנייטינג די השפּעה פון גדנאַ קאַנטאַמאַניישאַן.
2. אָנפאַנגער לענג
די אָנפאַנגער לענג איז בכלל צווישן 18-30 נט, און די לענג פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט זאָל זיין קאַנטראָולד צווישן 100-300 בפּ ווי פיל ווי מעגלעך.
אויב דער אָנפאַנגער איז צו קורץ, עס וועט פירן צו ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן, און אויב עס איז צו לאַנג, עס וועט לייכט פאָרעם צווייטיק סטרוקטור (אַזאַ ווי האַירפּין סטרוקטור).אויב די אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט איז צו לאַנג, עס איז נישט פּאַסיק פֿאַר דער אָפּרוף פון פּאָלימעראַסע, וואָס וועט ווירקן די עפעקטיווקייַט פון פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן.
3. גק אינהאַלט און טם ווערט
די GC אינהאַלט פון פּרימערז זאָל זיין קאַנטראָולד צווישן 40% און 60%.אויב עס איז צו הויך אָדער צו נידעריק, עס איז נישט קאַנדוסיוו צו אָנהייבן די אָפּרוף.די גק אינהאַלט פון די פאָרויס און פאַרקערט אָנפאַנגער זאָל זיין נאָענט צו די זעלבע אין סדר צו באַקומען די זעלבע טם ווערט און אַנילינג טעמפּעראַטור.
די טם ווערט זאָל זיין צווישן 55-65 °C ווי ווייַט ווי מעגלעך, בכלל אַרום 60 °C, און די טם ווערט פון די אַפּסטרים און דאַונסטרים זאָל זיין ווי נאָענט ווי מעגלעך, פּרעפעראַבלי ניט מער ווי 4 °C.
4. ויסמיידן סעלעקטינג א אין די 3′ סוף פון די אָנפאַנגער
ווען די 3′ סוף פון די אָנפאַנגער איז מיסמאַטשט, עס זענען גרויס דיפעראַנסיז אין די סינטעז עפעקטיווקייַט פון פאַרשידענע באַסעס.ווען די לעצטע באַזע איז א, עס קענען אויך אָנהייבן קייט סינטעז אפילו אין די פאַל פון מיסמאַטשינג, און ווען די לעצטע באַזע איז ט ווען, די עפעקטיווקייַט פון מיסמאַטש ינדאַקשאַן איז זייער רידוסט.דעריבער, פּרובירן צו ויסמיידן טשוזינג א אין די 3′ סוף פון די אָנפאַנגער, און עס איז בעסער צו קלייַבן T.
אויב עס איז אַ זאָנד אָנפאַנגער, די 5′ סוף פון די זאָנד קען נישט זיין G, ווייַל אפילו ווען אַ איין G באַזע איז קאָננעקטעד צו די FAM פלורעסאַנט רעפּאָרטער גרופּע, G קענען אויך שטילן די פלורעסאַנט סיגנאַל ימיטיד דורך די FAM גרופּע, ריזאַלטינג אין פאַלש נעגאַטיוו רעזולטאַטן.זיך באווייזן.
5. באַזע פאַרשפּרייטונג
די פאַרשפּרייטונג פון די פיר באַסעס אין די אָנפאַנגער איז פּרעפעראַבלי טראַפ, ויסמיידן מער ווי 3 קאָנסעקוטיווע G אָדער C אין די 3′ סוף, און מער ווי 3 קאָנסעקוטיווע.G אָדער C זענען גרינג צו דזשענערייט פּערינג אין די GC-רייַך סיקוואַנס געגנט.
6. דער אָנפאַנגער פּלאַן געגנט זאָל ויסמיידן קאָמפּלעקס צווייטיק סטראַקטשערז.
די צווייטיק סטרוקטור געשאפן דורך די איין שנירל פון די אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט וועט ווירקן די גלאַט פּראָגרעס פון פּקר.דורך פּרידיקטינג צי עס איז אַ צווייטיק סטרוקטור אין די ציל סיקוואַנס אין שטייַגן, פּרובירן צו ויסמיידן דעם געגנט אין די פּלאַן פון פּרימערז.
7. די אָנפאַנגער זיך און צווישן די אָנפאַנגער זאָל פּרובירן צו ויסמיידן קאָנסעקוטיווע קאַמפּלאַמענטשי באַסעס.
עס קען זיין קיין קאָנסעקוטיווע 4 באַזע קאַמפּלאַמענטשיקייט צווישן די אָנפאַנגער זיך און די אָנפאַנגער.דער אָנפאַנגער זיך זאָל נישט האָבן אַ קאַמפּלאַמענטשי סיקוואַנס, אַנדערש עס וועט פאַרלייגן זיך צו פאָרעם אַ האַירפּין סטרוקטור, וואָס וועט ווירקן די אַנילינג קאָמבינאַציע פון ​​די אָנפאַנגער און די מוסטער.
קאָמפּלעמענטאַרי סיקוואַנסיז קענען נישט עקסיסטירן צווישן אַפּסטרים און דאַונסטרים פּרימערז.קאָמפּלעמענטאַריטי צווישן פּרימערז וועט פּראָדוצירן אָנפאַנגער דימערז, וואָס וועט רעדוצירן פּקר עפעקטיווקייַט און אפילו ווירקן קוואַנטיטאַטיווע אַקיעראַסי.אויב די אָנפאַנגער-דימער און האַירפּין סטראַקטשערז זענען אַנאַוווידאַבאַל, די △G ווערט זאָל נישט זיין צו הויך (זאָל זיין ווייניקער ווי 4.5 קייקאַל / מאָל).
8. די פּרימערז אַמפּלאַפיי די ציל ספּעציפיש פּראָדוקט.
די לעצט ציל פון qPCR דיטעקשאַן איז צו פֿאַרשטיין די זעט פון די ציל דזשין.אויב ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן אַקערז, די קוואַנטאַפאַקיישאַן וועט זיין ומפּינקטלעך.דעריבער, נאָך די פּרימערז זענען דיזיינד, זיי דאַרפֿן צו זיין טעסטעד דורך BLAST, און די ספּעסיפיקייט פון די פּראָדוקטן איז קאַמפּערד אין די סיקוואַנס דאַטאַבייס.
דערנאָך, מיר נעמען די מענטש GAS6 (גראָוט אַרעסט ספּעציפיש 6) דזשין ווי אַ ביישפּיל צו פּלאַן qPCR אָנפאַנגער.
01 אָנפֿרעג דזשין
האָמאָ GAS6דורך NCBI.דאָ, מיר זאָל באַצאָלן ופמערקזאַמקייט צו קאַמפּערינג די דזשין נאָמען און מינים צו ענשור אַז זיי זענען קאָנסיסטענט.
02 געפֿינען די דזשין סיקוואַנס
(1) אויב די ציל סיקוואַנס איז גענאָמיק דנאַ, סעלעקטירן דעם ערשטער, וואָס איז די גענאָמיק דנאַ סיקוואַנס פון די דזשין.
(2) אויב די ציל סיקוואַנס איז מרנאַ, אויסקלייַבן די רגע.נאָך אַרייַן, גיט "CDS" אין די טיש אונטן.די ברוין הינטערגרונט סיקוואַנס איז די קאָדירונג סיקוואַנס פון די דזשין.
03 פּלאַן אָנפאַנגער
אַרייַן די Primer-BLAST צובינד
אַרייַן די דזשין סיקוואַנס נומער אָדער די סיקוואַנס אין פאַסטאַ פֿאָרמאַט אויף דער אויבערשטער לינקס, און פּלאָמבירן די באַטייַטיק פּאַראַמעטערס.

דריקט "באַקומען אָנפאַנגערס" און NCBI וועט קנאַל אַרויף צו זאָגן איר אַז אַזאַ פּאַראַמעטער סעלעקציע וועט זיין אַמפּלאַפייד צו אנדערע ספּלייינג וועריאַנץ.מיר קענען קאָנטראָלירן די פאַרשידענע ספּלייינג וועריאַנץ און פאָרלייגן זיי צו באַקומען די צונעמען אָנפאַנגער פּאָר (ווי געוויזן אין די פיגור אונטן).דעם פּראָצעס קען נעמען טענס פון סעקונדעס צו לויפן.
די אַנילינג טעמפּעראַטורעס פון די אָנפאַנגער פּערז זענען אַלע אַרום 60 ° C.לויט דער ציל פון דער עקספּערימענט, קלייַבן פּרימערז מיט מעסיק לענג, גוט ספּעציפֿישקייט און ווייניקער זיך-קאָמפּלעמענטאַטיאָן פון די פּרימערז פֿאַר דער עקספּערימענט, און די הצלחה קורס איז גאַנץ הויך!
04 פּרימער ספּעסיפיקאַטי וועראַפאַקיישאַן
אין אַדישאַן צו דיזיינינג אָנפאַנגער, Primer-Blast קענען אויך אָפּשאַצן די אָנפאַנגער וואָס מיר האָבן דיזיינד זיך.צוריקקומען צו די אָנפאַנגער פּלאַן בלאַט, אַרייַן די אַפּסטרים און דאַונסטרים אָנפאַנגער וואָס מיר דיזיינד, און אנדערע פּאַראַמעטערס וועט נישט זיין אַדזשאַסטיד.נאָך סאַבמיטינג, איר קענען זען צי די פּאָר פון פּרימערז אויך עקסיסטירן אויף אנדערע גענעס.אויב אַלע פון ​​זיי זענען געוויזן אויף די דזשין מיר ווילן צו פאַרשטאַרקן, וואָס ינדיקייץ אַז די ספּעציפֿישקייט פון דעם פּאָר פון פּרימערז איז גרויס!(למשל, דאָס איז דער בלויז רעזולטאַט פון די אָנפאַנגער אָנפֿרעג!)

05 אָנפאַנגער קוואַליטעט משפט
וואָס מין פון אָנפאַנגער איז די "גאנץ" אָנפאַנגער וואָס קאַמביינז "אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט אַרויף צו נאָרמאַל", "אַמפּלאַפייד פּראָדוקט קעראַקטעריסטיקס" און "פאַרלאָזלעך יקספּערמענאַל רעזולטאַטן"?
אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט

מעלטינג ויסבייג
די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט פון די אָנפאַנגער ריטשאַז 90%-110%, וואָס מיטל אַז די אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט איז גוט, און די מעלטינג ויסבייג האט אַ איין שפּיץ און יוזשאַוואַלי טמ>80°C, וואָס מיטל אַז די אַמפּלאַפאַקיישאַן ספּעסיפיקאַטי איז גוט.
 
פֿאַרבונדענע פּראָדוקטן:
פאַקטיש צייט PCR Easy–SYBR GREEN I
פאַקטיש צייט פּקר Easy-Takman