• פּקר איז אַ מעטאָד געניצט צו אַמפּלאַפיי דנאַ פֿון אַ קליין סומע פון ​​דנאַ מוסטער.RT-PCR ניצט פאַרקערט טראַנסקריפּציע צו פּראָדוצירן אַ דנאַ מוסטער פֿון אַ רנאַ מקור וואָס קענען זיין אַמפּלאַפייד.
• פּקר און רט-פּקר זענען טיפּיקלי ענדפּוינט ריאַקשאַנז, בשעת qPCR און RT-qPCR נוצן די קינעטיק פון די פּראָדוקט סינטעז קורס בעשאַס די פּקר אָפּרוף צו קוואַנטייט די סומע פון ​​​​טעמפּלאַטע פאָרשטעלן.
• נייַער מעטהאָדס, אַזאַ ווי דיגיטאַל פּקר, צושטעלן אַבסאָלוט קוואַנטיטאַטיאָן פון די ערשט דנאַ מוסטער, בשעת מעטהאָדס אַזאַ ווי יסאָטהערמאַל פּקר רעדוצירן די נויט פֿאַר טייַער ויסריכט צו צושטעלן פאַרלאָזלעך רעזולטאַטן.

פּאָלימעראַסע קייט רעאַקציע (PCR) איז אַ לעפיערעך פּשוט און וויידלי געניצט מאָלעקולאַר ביאָלאָגי טעכניק צו אַמפּלאַפיי און דעטעקט דנאַ און רנאַ סיקוואַנסיז.קאַמפּערד מיט טראדיציאנעלן מעטהאָדס פון דנאַ קלאָונינג און אַמפּלאַפאַקיישאַן, וואָס קען אָפט נעמען טעג, PCR ריקווייערז בלויז אַ ביסל שעה.PCR איז העכסט שפּירעוודיק און ריקווייערז מינימאַל מוסטער פֿאַר דיטעקשאַן און אַמפּלאַפאַקיישאַן פון ספּעציפיש סיקוואַנסיז.יקערדיק פּקר מעטהאָדס האָבן מער אַוואַנסירטע פֿון פּשוט דנאַ און רנאַ דיטעקשאַן.ונטער, מיר האָבן צוגעשטעלט אַן איבערבליק פון די פאַרשידענע פּקר מעטהאָדס און די רייידזשאַנץ וואָס מיר צושטעלן אין Enzo Life Sciences פֿאַר דיין פאָרשונג דאַרף.מיר צילן צו העלפֿן סייאַנטיס געשווינד אַקסעס PCR רייידזשאַנץ צו נוצן אין זייער ווייַטער פאָרשונג פּרויעקט!

PCR

פֿאַר נאָרמאַל פּקר, אַלע איר דאַרפֿן איז אַ דנאַ פּאָלימעראַסע, מאַגניזיאַם, נוקלעאָטידעס, פּרימערז, די דנאַ מוסטער צו זיין אַמפּלאַפייד און אַ טערמאָסיקלער.די פּקר מעקאַניזאַם איז ווי פּשוט ווי זייַן ציל: 1) טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ (דסדנאַ) איז היץ דענאַטורעד, 2) פּרימערז ייַנרייען זיך צו די איין דנאַ סטראַנדז, און 3) די אָנפאַנגערס זענען עקסטענדעד דורך דנאַ פּאָלימעראַסע, ריזאַלטינג אין צוויי קאפיעס פון די אָריגינעל דנאַ שנירל.די דענאַטוראַטיאָן, אַנילינג, און ילאָנגגיישאַן פּראָצעס איבער אַ סעריע פון ​​טעמפּעראַטורעס און צייט איז באקאנט ווי איין ציקל פון אַמפּלאַפאַקיישאַן (פיגורע 1).

יעדער שריט פון די ציקל זאָל זיין אָפּטימיזעד פֿאַר די געוויינט מוסטער און אָנפאַנגער שטעלן.דעם ציקל איז ריפּיטיד בעערעך 20-40 מאל, און די אַמפּלאַפייד פּראָדוקט קענען זיין אַנאַלייזד, טיפּיקלי דורך אַגאַראָסע געל (Fig. 2).

ווי פּקר איז אַ העכסט שפּירעוודיק אופֿן און זייער קליין וואַליומז זענען פארלאנגט פֿאַר איין ריאַקשאַנז, די צוגרייטונג פון אַ בעל מישן פֿאַר עטלעכע ריאַקשאַנז איז רעקאַמענדיד.דער בעל מיקס מוזן זיין געזונט געמישט און דעמאָלט שפּאַלטן דורך די נומער פון ריאַקשאַנז, ינשורינג אַז יעדער אָפּרוף וועט אַנטהאַלטן די זעלבע סומע פון ​​ענזיים, דנטפּס און אָנפאַנגערס.פילע סאַפּלייערז, אַזאַ ווי ענזאָ לעבן ססיענסעס, אויך פאָרשלאָגן פּקר מיקסעס וואָס שוין אַנטהאַלטן אַלץ אַחוץ אָנפאַנגערס און די דנאַ מוסטער.

גואַנינע / סיטאָסינע-רייַך (גק-רייַך) מקומות פאָרשטעלן אַ אַרויסרופן אין נאָרמאַל פּקר טעקניקס.גק-רייַך סיקוואַנסיז זענען מער סטאַביל ווי סיקוואַנסיז מיט נידעריקער גק אינהאַלט.דערצו, גק-רייַך סיקוואַנסיז טענד צו פאָרעם צווייטיק סטראַקטשערז, אַזאַ ווי האַירפּין לופּס.ווי אַ רעזולטאַט, GC-רייַך טאָפּל סטראַנדז זענען שווער צו גאָר באַזונדער בעשאַס די דענאַטראַטיאָן פאַסע.דעריבער, דנאַ פּאָלימעראַסע קענען נישט סינטאַסייז די נייַ שנירל אָן כינדראַנס.א העכער דינאַטוראַטיאָן טעמפּעראַטור קענען פֿאַרבעסערן דעם, און אַדזשאַסטמאַנץ צו אַ העכער אַנילינג טעמפּעראַטור און קירצער אַנילינג צייט קענען פאַרמייַדן די אַנספּאַסיפיק ביינדינג פון גק-רייַך אָנפאַנגערס.נאָך רייידזשאַנץ קענען פאַרבעסערן די אַמפּלאַפאַקיישאַן פון גק-רייַך סיקוואַנסיז.DMSO, גליסעראָל און בעטאַינע העלפֿן צו צעשטערן די צווייטיק סטראַקטשערז וואָס זענען געפֿירט דורך GC ינטעראַקשאַנז און דערמיט פאַסילאַטייט די צעשיידונג פון די טאָפּל סטראַנדז.

הייס אָנהייב פּקר

ונספּעסיפיק אַמפּלאַפאַקיישאַן איז אַ פּראָבלעם וואָס קען פּאַסירן בעשאַס פּקר.רובֿ דנאַ פּאָלימעראַסעס וואָס זענען געניצט פֿאַר פּקר אַרבעט בעסטער אין טעמפּעראַטורעס אַרום 68 ° C צו 72 ° C.דער ענזיים קען, אָבער, אויך זיין אַקטיוו ביי נידעריקער טעמפּעראַטורעס, כאָטש צו אַ נידעריקער גראַד.אין טעמפּעראַטורעס ווייַט אונטער די אַנילינג טעמפּעראַטור, אָנפאַנגער קענען בינדן ניט-ספּעציפיש און פירן צו ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן, אַפֿילו אויב דער אָפּרוף איז שטעלן זיך אויף אייז.דעם קענען זיין פּריווענטיד דורך ניצן פּאָלימעראַסע ינכיבאַטערז וואָס דיססאָסיאַטע פון ​​די דנאַ פּאָלימעראַסע בלויז אַמאָל אַ זיכער טעמפּעראַטור איז ריטשט, דערפאר דער טערמין הייס אָנהייב פּקר.דער ינכיבאַטער קענען זיין אַן אַנטיבאָדי וואָס ביינדז די פּאָלימעראַסע און דענאַטורעס אין דער ערשט דענאַטוראַטיאָן טעמפּעראַטור (טיפּיקלי 95 ° C).

הויך פידעליטי פּאָלימעראַסע

בשעת דנאַ פּאָלימעראַסעס אַמפּליפייז פערלי אַקיעראַטלי צו דער אָריגינעל מוסטער סיקוואַנס, מיסטייקס אין נוקלעאָטידע ריכטן קענען פּאַסירן.מיסמאַטשעס אין אַפּלאַקיישאַנז אַזאַ ווי קלאָונינג קענען רעזולטאַט אין טראַנגקייטיד טראַנסקריפּץ און מיסטראַנסלאַטעד אָדער ינאַקטיוו פּראָטעינס דאַונסטרים.צו ויסמיידן די מיסמאַטשאַז, פּאָלימעראַסעס מיט אַ "פּרופרעאַדינג" טעטיקייט האָבן שוין יידענאַפייד און ינקאָרפּערייטיד אין די וואָרקפלאָוו.דער ערשטער פּרופרעאַדינג פּאָלימעראַסע, Pfu, איז געווען יידענאַפייד אין 1991 אין Pyrococcus furiosus.דעם פּפו ענזיים האט אַ 3' צו 5' עקסאָנוקלעאַסע טעטיקייט.ווען די דנאַ איז אַמפּלאַפייד, די עקסאָנוקלעאַסע רימוווז מיסמאַטשט נוקלעאָטידעס אין די 3 'סוף פון די שנירל.דער ריכטיק נוקלעאָטידע איז דעמאָלט ריפּלייסט, און דנאַ סינטעז האלט.די לעגיטימאַציע פון ​​פאַלש נוקלעאָטידע סיקוואַנסיז איז באזירט אויף די ביינדינג קירבות פֿאַר די ריכטיק נוקלעאָסידע טריפאָספאַטע מיט די ענזיים, ווו באַטלאָניש ביינדינג סלאָוז די סינטעז און אַלאַוז די ריכטיק פאַרבייַט.די פּרורעאַדינג טעטיקייט פון Pfu פּאָלימעראַסע רעזולטאַטן אין ווייניקערע ערראָרס אין די לעצט סיקוואַנס קאַמפּערד מיט Taq DNA פּאָלימעראַסע.אין די לעצטע יאָרן, אנדערע פּרופרידינג ענזימעס זענען יידענאַפייד, און מאָדיפיקאַטיאָנס פון דער אָריגינעל Pfu ענזיים זענען געמאכט צו ווייַטער רעדוצירן די טעות קורס בעשאַס דנאַ אַמפּלאַפאַקיישאַן.

רט-פּקר

פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּקר, אָדער RT-PCR, אַלאַוז די נוצן פון רנאַ ווי אַ מוסטער.אַן נאָך שריט אַלאַוז די דיטעקשאַן און אַמפּלאַפאַקיישאַן פון רנאַ.די רנאַ איז פאַרקערט טראַנסקריבעד אין קאָמפּלעמענטאַרי דנאַ (קדנאַ), ניצן פאַרקערט טראַנסקריפּציע.די קוואַליטעט און ריינקייַט פון די רנאַ מוסטער זענען יקערדיק פֿאַר די הצלחה פון RT-PCR.דער ערשטער שריט פון RT-PCR איז די סינטעז פון אַ דנאַ / רנאַ כייבריד.פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע אויך האט אַ רנאַסע ה פונקציע, וואָס דיגרייד די רנאַ חלק פון די כייבריד.די איין-סטראַנדיד דנאַ מאַלאַקיול איז דערנאָך געענדיקט דורך די דנאַ-אָפענגיק דנאַ פּאָלימעראַסע טעטיקייט פון די פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע אין cDNA.די עפעקטיווקייַט פון דער ערשטער-שנירל אָפּרוף קענען ווירקן די אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָצעס.פֿון דאָ אויף, די נאָרמאַל פּקר פּראָצעדור איז געניצט צו אַמפּלאַפיי די cDNA.די מעגלעכקייט צו צוריקקריגן רנאַ אין cDNA דורך RT-PCR האט פילע אַדוואַנטידזשיז, און עס איז בפֿרט געניצט פֿאַר דזשין אויסדרוק אַנאַליסיס.רנאַ איז איין-סטראַנדיד און זייער אַנסטייבאַל, וואָס מאכט עס טשאַלאַנדזשינג צו אַרבעטן מיט.עס קאַמאַנלי סערוועס ווי דער ערשטער שריט אין qPCR, וואָס קוואַנטאַפייז רנאַ טראַנסקריפּץ אין אַ בייאַלאַדזשיקאַל מוסטער.

qPCR און RT-qPCR

קוואַנטיטאַטיווע פּקר (קפּקר) איז געניצט צו דעטעקט, קעראַקטערייז און קוואַנטיפיי נוקלעיק אַסאַדז פֿאַר פילע אַפּלאַקיישאַנז.אין RT-qPCR, רנאַ טראַנסקריפּץ זענען אָפט קוואַנטאַפייד דורך פאַרקערט טראַנסקריבינג זיי אין cDNA ערשטער, ווי דיסקרייבד אויבן, און דערנאָך qPCR איז דורכגעקאָכט.ווי אין נאָרמאַל פּקר, דנאַ איז אַמפּלאַפייד דורך דריי ריפּיטינג סטעפּס: דענאַטוראַטיאָן, אַנילינג און ילאָנגגיישאַן.אָבער, אין qPCR, פלורעסאַנט לייבלינג ינייבאַלז די זאַמלונג פון דאַטן ווי פּקר פּראָגרעסיז.דעם טעכניק האט פילע בענעפיץ רעכט צו דער קייט פון מעטהאָדס און כעמיע בנימצא.

אין פאַרב-באזירט qPCR (טיפּיקלי גרין), פלורעסאַנט לייבלינג אַלאַוז די קוואַנטאַפאַקיישאַן פון די אַמפּלאַפייד דנאַ מאַלאַקיולז דורך ניצן אַ דסדנאַ ביינדינג פאַרב.בעשאַס יעדער ציקל, די פלואָרעססענסע איז געמאסטן.די פלורעסאַנס סיגנאַל ינקריסיז פּראַפּאָרשאַנאַל צו די סומע פון ​​רעפּליקייטיד דנאַ.דערפאר, די דנאַ איז קוואַנטאַפייד אין "פאַקטיש-צייט" (Fig. 3).די דיסאַדוואַנטידזשיז צו פאַרב-באזירט qPCR זענען אַז בלויז איין ציל קענען זיין יגזאַמאַנד אין אַ צייט און אַז די פאַרב וועט בינדן צו קיין דס-דנאַ פאָרשטעלן אין דער מוסטער.

אין זאָנד-באזירט qPCR, פילע טאַרגאַץ קענען זיין דיטעקטאַד סיימאַלטייניאַסלי אין יעדער מוסטער, אָבער דאָס ריקווייערז אַפּטאַמאַזיישאַן און פּלאַן פון אַ ציל-ספּעציפיש זאָנד (s) געניצט אין אַדישאַן צו פּרימערז.עטלעכע טייפּס פון זאָנד דיזיינז זענען בנימצא, אָבער די מערסט פּראָסט טיפּ איז אַ כיידראַלאַסאַס זאָנד, וואָס ינקאָרפּערייץ אַ פלואָראָפאָר און קווענטשער.פלואָרעססענסע רעזאַנאַנס ענערגיע אַריבערפירן (FRET) פּריווענץ די ימישאַן פון די פלואָראָפאָר דורך די קווענטשער בשעת די זאָנד איז בעשאָלעם.אָבער, בעשאַס די פּקר אָפּרוף, די זאָנד איז כיידראַלייזד בעשאַס אָנפאַנגער פאַרלענגערונג און אַמפּלאַפאַקיישאַן פון די ספּעציפיש סיקוואַנס עס איז געבונדן צו.די קלעאַוואַגע פון ​​די זאָנד סעפּערייץ די פלואָראָפאָר פון די קווענטשער און רעזולטאטן אין אַ אַמפּלאַפאַקיישאַן-אָפענגיק פאַרגרעסערן אין פלואָרעססענסע (Fig. 4).אזוי, די פלואָרעססענסע סיגנאַל פון אַ זאָנד-באזירט קפּקר אָפּרוף איז פּראַפּאָרשאַנאַל צו די סומע פון ​​​​די זאָנד ציל סיקוואַנס פאָרשטעלן אין דער מוסטער.ווייַל זאָנד-באזירט qPCR איז מער ספּעציפיש ווי פאַרב-באזירט qPCR, עס איז אָפט די טעכנאָלאָגיע געניצט אין qPCR-באזירט דיאַגנאָסטיק אַססעס.

יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן

די פּקר דערמאנט אויבן טעקניקס ריקווייערז טייַער טערמאָסיקלינג עקוויפּמענט צו אַקיעראַטלי ראַמפּע אַרויף און אַראָפּ קאַמער טעמפּעראַטורעס פֿאַר די דינאַטוריישאַן, אַנילינג און פאַרלענגערונג סטעפּס.עס זענען דעוועלאָפּעד אַ נומער פון טעקניקס וואָס טאָן ניט דאַרפֿן אַזאַ גענוי דעוויסעס און קענען זיין דורכגעקאָכט אין אַ פּשוט וואַסער וואַנע אָדער אפילו אין די צעל פון אינטערעס.די טעקניקס זענען קאַלעקטיוולי גערופן יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן און אַרבעט באזירט אויף עקספּאָונענשאַל, לינעאַר אָדער קאַסקייד אַמפּלאַפאַקיישאַן.

דער בעסטער-באקאנט טיפּ פון יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן איז שלייף-מעדיאַטעד יסאָטהערמאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן, אָדער לאָמפּ.LAMP ניצט עקספּאָונענשאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן ביי 65⁰C צו אַמפּלאַפיי מוסטער דנאַ אָדער רנאַ.ווען פּערפאָרמינג LAMP, פיר צו זעקס פּרימערז קאַמפּלאַמענטשי צו מקומות פון די ציל דנאַ זענען געניצט מיט אַ דנאַ פּאָלימעראַסע צו סינטאַסייז נייַ דנאַ.צוויי פון די אָנפאַנגערס האָבן פּאָזיטיוו סיקוואַנסיז וואָס דערקענען סיקוואַנסיז אין די אנדערע אָנפאַנגערס און בינדן זיי, אַלאַוינג פֿאַר אַ "שלייף" סטרוקטור צו פאָרעם אין די ניי סינטאַסייזד דנאַ וואָס דערנאָך אַידז אָנפאַנגער אַנילינג אין סאַבסאַקוואַנט ראָונדס פון אַמפּלאַפאַקיישאַן.לאָמפּ קענען זיין וויזשוואַלייזד דורך קייפל מעטהאָדס, אַרייַנגערעכנט פלואָרעססענסע, אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס אָדער קאָלאָרימעטרי.די יז פון וויזשוואַלייזינג און דיטעקטינג די בייַזייַן אָדער פעלן פון פּראָדוקט דורך קאָלאָרימעטרי און די פעלן פון טייַער ויסריכט פארלאנגט געמאכט LAMP אַ פּאַסיק אָפּציע פֿאַר סאַרס-קאָוו -2 טעסטינג אין געביטן ווו קליניש לאַב טעסטינג איז נישט גרינג בנימצא, אָדער סטאָרידזש און אַריבערפירן פון סאַמפּאַלז איז ניט פיזאַבאַל, אָדער אין לאַבאָראַטאָריעס וואָס האָבן נישט פריער האָבן פּקר טערמאָסיקלינג ויסריכט.