סטאַרטינג מאַטעריאַל: רנאַ
קוואַנטיטאַטיווע פאַרקערט טראַנסקריפּציע פּקר (RT-qPCR) איז אַן יקספּערמענאַל אופֿן געניצט אין פּקר יקספּעראַמאַנץ ניצן רנאַ ווי די סטאַרטינג מאַטעריאַל.אין דעם אופֿן, גאַנץ רנאַ אָדער שליח רנאַ (מרנאַ) איז ערשטער טראַנסקריבעד אין קאַמפּלאַמענטשי דנאַ (קדנאַ) דורך פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע.דערנאָך, אַ qPCR אָפּרוף איז דורכגעקאָכט מיט די cDNA ווי אַ מוסטער.RT-qPCR איז געניצט אין אַ פאַרשיידנקייַט פון מאָלעקולאַר ביאָלאָגי אַפּלאַקיישאַנז, אַרייַנגערעכנט דזשין אויסדרוק אַנאַליסיס, רנאַ ינטערפיראַנס וואַלאַדיישאַן, מיקראָאַררייַ וואַלאַדיישאַן, פּאַטאַדזשאַן דיטעקשאַן, גענעטיק טעסטינג און קרענק פאָרשונג.
איין-שריט און צוויי-שריט מעטהאָדס פֿאַר RT-qPCR
RT-qPCR קענען זיין אַטשיווד דורך אַ איין-שריט אָדער צוויי-שריט אופֿן.איין-שריט RT-qPCR קאַמביינז פאַרקערט טראַנסקריפּציע און פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן, אַלאַוינג פאַרקערט טראַנסקריפּציע און דנאַ פּאָלימעראַסע צו פאַרענדיקן דעם אָפּרוף אין דער זעלביקער רער אונטער די זעלבע באַפער טנאָים.איין-שריט RT-qPCR בלויז ריקווייערז די נוצן פון סיקוואַנס-ספּעציפיש פּרימערז.אין צוויי-שריט RT-qPCR, פאַרקערט טראַנסקריפּציע און פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן זענען דורכגעקאָכט אין צוויי טובז, ניצן פאַרשידענע אָפּטימיזעד באַפערז, אָפּרוף טנאָים און אָנפאַנגער פּלאַן סטראַטעגיעס.
| מייַלע | כיסאָרן | |
| איין שריט | דער אופֿן האט ווייניקער יקספּערמענאַל טעות ווייַל ביידע ריאַקשאַנז זענען געטאן אין איין רער
ווייניקערע פּיפּעטטינג סטעפּס רעדוצירן די ריזיקירן פון קאַנטאַמאַניישאַן
פּאַסיק פֿאַר הויך-טראַפּוט אַמפּלאַפאַקיישאַן / זיפּונג, שנעל און רעפּראָדוסיבלע | צוויי-שריט ריאַקשאַנז קענען ניט זיין אָפּטימיזעד סעפּעראַטלי
זינט די רעאַקציע טנאָים זענען קאַמפּראַמייזד דורך קאַמביינינג די צוויי-שריט אָפּרוף, די סענסיטיוויטי איז נישט ווי גוט ווי די פון די צוויי-שריט אופֿן
די נומער פון טאַרגאַץ דיטעקטאַד דורך אַ איין מוסטער איז קליין |
| צוויי סטעפּס | פיייקייט צו שאַפֿן סטאַביל cDNA לייברעריז וואָס קענען זיין סטאָרד פֿאַר לאַנג פּיריאַדז און געוויינט אין קייפל ריאַקשאַנז
ציל גענעס און רעפֿערענץ גענעס קענען זיין אַמפּלאַפייד פֿון דער זעלביקער cDNA ביבליאָטעק אָן די נויט פֿאַר קייפל cDNA לייברעריז
אָפּרוף באַפערז און אָפּרוף טנאָים וואָס געבן אַפּטאַמאַזיישאַן פון איין אָפּרוף ראַנז
פלעקסאַבאַל סעלעקציע פון צינגל טנאָים | ניצן קייפל טובז און מער פּיפּטטינג סטעפּס ינקריסאַז די ריזיקירן פון דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן, און צייט קאַנסומינג.
ריקוויירז מער אַפּטאַמאַזיישאַן ווי די איין-שריט אופֿן |
פֿאַרבונדענע פּראָדוקטן:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (איין סטעפּ)-SYBR גרין I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (איין סטעפּ)-טאַקמאַן
RT Easyᵀᴹ איך מאַסטער פּרעמיקס פֿאַר ערשטער-סטראַנד CDNA סינטעז
פאַקטיש צייט PCR Easyᵀᴹ-SYBR גרין איך קיט
פאַקטיש צייט פּקר Easyᵀᴹ-טאַקמאַן
סעלעקציע פון גאַנץ רנאַ און מרנאַ
ווען דיזיינינג אַן RT-qPCR עקספּערימענט, עס איז וויכטיק צו באַשליסן צי צו נוצן גאַנץ רנאַ אָדער פּיוראַפייד מרנאַ ווי אַ מוסטער פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע.כאָטש mRNA קען זיין אַ ביסל העכער סענסיטיוויטי, גאַנץ רנאַ איז נאָך אָפט געניצט.די סיבה פֿאַר דעם איז אַז גאַנץ רנאַ האט אַ מער וויכטיק מייַלע ווי אַ סטאַרטינג מאַטעריאַל ווי מרנאַ.ערשטער, דער פּראָצעס ריקווייערז ווייניקערע רייניקונג סטעפּס, וואָס ינשורז בעסער קוואַנטיטאַטיווע אָפּזוך פון מוסטער און בעסער נאָרמאַליזיישאַן פון רעזולטאַטן צו סטאַרטינג צעל נומערן.רגע, עס אַוווידז די mRNA ענריטשמענט שריט, וואָס קענען ויסמיידן די מעגלעכקייט פון סקיוד רעזולטאַטן רעכט צו פאַרשידענע ריקאַוועריז פון פאַרשידענע מרנאַ.קוילעלדיק, זינט אין רובֿ אַפּלאַקיישאַנז די קאָרעוו קוואַנטאַפאַקיישאַן פון די ציל דזשין איז מער וויכטיק ווי די אַבסאָלוט סענסיטיוויטי פון די דיטעקשאַן, גאַנץ רנאַ איז מער פּאַסיק אין רובֿ קאַסעס.
פאַרקערט טראַנסקריפּציע אָנפאַנגער
אין די צוויי-שריט אופֿן, דריי פאַרשידענע מעטהאָדס קענען ווערן גענוצט צו אָנפירן די cDNA אָפּרוף: אָליגאָ (דט) אָנפאַנגערס, טראַפ - אָנפאַנגער אָדער סיקוואַנס-ספּעציפיש אָנפאַנגער.טיפּיקאַללי, אָליגאָ (דט) פּרימערז און טראַפ - פּרימערז זענען געניצט אין קאָמבינאַציע.די אָנפאַנגערס אַנאַלייז צו די מוסטער מרנאַ שנירל און צושטעלן פאַרקערט טראַנסקריפּציע מיט אַ סטאַרטינג פונט פֿאַר סינטעז.
| אָנפאַנגער סעלעקציע | סטרוקטור און פֿונקציע | מייַלע | כיסאָרן |
| אָליגאָ (דט) אָנפאַנגער (אָדער אַנגקערד אָליגאָ (דט) אָנפאַנגער) | עקסטענדעד אַנילינג צו טהימינע רעזאַדוז אין די פּאָלי (א) עק פון מרנאַ;אַנקער אָליגאָ (דט) אָנפאַנגער כּולל אַ ג, C אָדער א אין די 3′ סוף (אַנקער פּלאַץ) | סינטעז פון פול-לענג קדנאַ פון פּאָלי (א)-טיילד מרנאַ
אָנווענדלעך ווען ווייניקער סטאַרטינג מאַטעריאַל איז בנימצא
אַנגקערינג פּלאַץ ינשורז אַז די אָליגאָ (דט) אָנפאַנגער ביינדז צו די 5 ′ פּאָלי (א) עק פון די מרנאַ | בלויז פּאַסיק פֿאַר אַמפּלאַפייינג גענעס מיט פּאָלי (א) עקן
באַקומען cDNA טראַנגקייטיד פון די פּרימינג פּלאַץ * 2 אין פּאָלי (א)
בייאַסט צו בינדן צו די 3′ סוף *
* די מעגלעכקייט איז מינאַמייזד אויב אַנגקערד אָליגאָ (דט) פּרימערז זענען געניצט |
| טראַפ - אָנפאַנגער
| 6 צו 9 באַסעס אין לענג, וואָס קענען אַנאַלייז צו קייפל זייטלעך בעשאַס רנאַ טראַנסקריפּציע | אַנאַל צו אַלע רנאַ (טרנאַ, ררנאַ און מרנאַ)
פּאַסיק פֿאַר טראַנסקריפּץ מיט באַטייַטיק צווייטיק סטרוקטור, אָדער ווען ווייניקער סטאַרטינג מאַטעריאַל איז בנימצא
הויך cDNA Yield | cDNA איז פאַרקערט טראַנסקריבעד פון אַלע רנאַ, וואָס איז יוזשאַוואַלי ניט געוואלט און קען צעפירן די סיגנאַל פון די ציל מרנאַ.
באַקומען טראַנגקייטיד cDNA |
| סיקוואַנס-ספּעציפיש פּרימערז | מנהג פּרימערז טאַרגאַטינג ספּעציפיש מרנאַ סיקוואַנסיז | ספּעציפיש cDNA ביבליאָטעק
פֿאַרבעסערן סענסיטיוויטי
ניצן פאַרקערט qPCR אָנפאַנגער | בלויז לימיטעד צו די סינטעז פון אַ איין ציל דזשין |
פאַרקערט טראַנסקריפּציע
פאַרקערט טראַנסקריפּציע איז אַן ענזיים וואָס ניצט רנאַ צו סינטאַסייז דנאַ.עטלעכע פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסאַז האָבן רנאַסע טעטיקייט און קענען דיגרייד רנאַ סטראַנדז אין רנאַ-דנאַ כייבריד סטראַנדז נאָך טראַנסקריפּציע.אויב עס טוט נישט האָבן RNase ענזימאַטיק טעטיקייט, RNaseH קענען זיין מוסיף פֿאַר העכער qPCR עפעקטיווקייַט.קאַמאַנלי געניצט ענזימעס אַרייַננעמען קאַפּויער טראַנסקריפּטאַסע Moloney murine לוקימיאַ ווירוס און אַוויאַן מיעלאָבלאַסטאָמאַ ווירוס פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע.פֿאַר RT-qPCR, עס איז ידעאַל צו קלייַבן אַ פאַרקערט טראַנסקריפּציע מיט העכער טערמאַסטאַביליטי, אַזוי אַז cDNA סינטעז קענען זיין דורכגעקאָכט ביי העכער טעמפּעראַטורעס, און ינשורינג אַ מצליח טראַנסקריפּציע פון רנאַ מיט העכער צווייטיק סטרוקטור, בשעת זיי האַלטן זייער פול טעטיקייט איבער דער אָפּרוף, ריזאַלטינג אין העכער cDNA ייעלדס.
פֿאַרבונדענע פּראָדוקטן:
פאָרעאַסי M-MLV פאַרקערט טראַנסקריפּציע
RNase H טעטיקייט פון פאַרקערט טראַנסקריפּציע
RNaseH איז ביכולת צו דיגרייד רנאַ סטראַנדז פון רנאַ-דנאַ דופּלעקסאַז, אַלאַוינג עפעקטיוו סינטעז פון טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ.אָבער, ווען ניצן לאַנג מרנאַ ווי אַ מוסטער, די רנאַ קען זיין דיגריידיד פּרימאַטשורלי, ריזאַלטינג אין טראַנגקייטיד קדנאַ.דעריבער, עס איז אָפט וווילטויק צו מינאַמייז RNaseH טעטיקייט בעשאַס cDNA קלאָונינג אויב סינטעז פון לאַנג טראַנסקריפּץ איז געוואלט.אין קאַנטראַסט, פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסאַז מיט RNase H טעטיקייט זענען אָפט וווילטויק פֿאַר qPCR אַפּלאַקיישאַנז ווייַל זיי פאַרבעסערן די מעלטינג פון RNA-DNA דופּלעקסאַז בעשאַס דער ערשטער ציקל פון פּקר.
אָנפאַנגער פּלאַן
פּקר אָנפאַנגערס געניצט פֿאַר די qPCR שריט אין RT-qPCR זאָל יידילי זיין דיזיינד צו שפּאַן אַן עקסאָן-עקסאָן קנופּ, ווו אַ אַמפּלאַפאַקיישאַן אָנפאַנגער קען פּאַטענטשאַלי שפּאַן אַן פאַקטיש עקסאָן-ינטראָן גרענעץ.זינט ינטראָן-מיט גענאָמיק דנאַ סיקוואַנסיז זענען נישט אַמפּלאַפייד, דעם פּלאַן ראַדוסאַז די ריזיקירן פון פאַלש פּאַזאַטיווז אַמפּלאַפייד פון קאַנטאַמאַנייטינג גענאָמיק דנאַ.
אויב אָנפאַנגערס קענען ניט זיין דיזיינד צו צעטיילן עקסאָנס אָדער עקסאָן-עקסאָן באַונדריז, עס קען זיין נייטיק צו מייַכל רנאַ סאַמפּאַלז מיט רנאַסע-פֿרייַ דנאַסע איך אָדער דסדנאַסע צו באַזייַטיקן גענאָמיק דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן.
רט-קפּקר קאָנטראָל
א פאַרקערט טראַנסקריפּציע נעגאַטיוו קאָנטראָל (-RT קאָנטראָל) זאָל זיין אַרייַנגערעכנט אין אַלע RT-qPCR יקספּעראַמאַנץ צו דעטעקט דנאַ קאַנטאַמאַניישאַן (אַזאַ ווי גענאָמיק דנאַ אָדער פּקר פּראָדוקטן פון פרייַערדיק ריאַקשאַנז).דער קאָנטראָל כּולל אַלע אָפּרוף קאַמפּאָונאַנץ אַחוץ פאַרקערט טראַנסקריפּטאַסע.זינט פאַרקערט טראַנסקריפּציע טוט נישט פּאַסירן מיט דעם קאָנטראָל, אויב פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן איז באמערקט, קאַנטאַמאַניישאַן פון דנאַ איז רובֿ מסתּמא.
פּאָסטן צייט: Aug-02-2022
